50лет иппи ран нейрофизиология, биофизика и психофизика в иппи ран: истоки и современность
жүктеу/скачать 2.44 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Биологические результаты
- Эволюция РНК-полимераз и их промоторов в пластидах А.В. Селиверстов, В.А. Любецкий (ИППИ РАН) РНК-полимеразы бактериального типа у споровиков
- Промоторы в пластидах кокцидий
- РНК-полимеразы фагового типа у споровико
- РНК-полимеразы бактериального типа у водорослей
- Предсказание промоторов бактериального типа в пластидах у водорослей
- Отдел Вид (номер пластома в базе NCBI) Число пр. Число σ
Терминаторы транскрипции. У человека известно два терминатора с существенно разными механизмами действия. Один терминатор обусловлен связыванием белка mTERF с сайтом на ДНК длиной 28 п.н., расположенным внутри гена тРНК-Leu. Из результатов [Ammini, Hauswirth, 1999] следует, что у эмбрионов лягушки незначительная часть РНК-полимераз транскрибирует ген 16S рРНК в антисмысловом направлении, однако доля таких РНК-полимераз, преодолевающих терминатор, близка к нулю. Транзиция A→G в позиции 3243, в середине сайта связывания белка mTERF, существенно снижает связь mTERF с последовательностью ДНК и вызывает тяжелые наследственные заболевания человека (MELAS болезни). Влияние мутаций, разрушающих сайт связывания этого терминатора, на частоту транскрипции у человека таково: для рРНК изменение незначительное, для тРНК-Leu отклонение до 20% от нормы, для тРНК-Lys отклонение до 40-50% от нормы, для генов, кодирующих белки, среднее отклонение незначительно, хотя результат трансляции для многих генов нарушается значительно [Chomyn et al., 1992]. У млекопитающих белок mTERF кооперативно связывает одновременно сайт терминации и сайт на ДНК вблизи промотора HSP1, активируя транскрипцию с него [Martin et al., 2005]. В работе [Valverde et al., 1994] показана консервативность сайта терминации ниже 16S рРНК в митохондриях многих видов животных. Белок-независимый терминатор в митохондриях человека расположен в позициях 282..300 на легкой цепи. Согласно работе [Wanrooij et al., 2010] этот терминатор вызывает терминацию около 65% транскриптов, начинающихся с LSP. Этот терминатор является строго поляризованным, поскольку терминация обусловлена формированием гуанилового тетрамера на РНК. У крысы и лягушки этот терминатор предсказан нами биоинформатически.
Для белок-кодирующих генов известны их относительные количества M[k] молекул РНК в митохондрии; пусть k пробегает имена генов. Также известны времена полураспада t[k] соответствующих РНК, а также – доверительные интервалы ΔM[k] и Δt[k] этих величин. Обозначим L[k] отношение уровня транскрипции k-го гена к произведению уровня транскрипции фиксированного выделенного гена на время его полураспада. Уровни транскрипции всех генов вычисляются в модели; их, как и величину L[k], трудно измерить непосредственно. В правильной модели в стационарном состоянии митохондрии величины L[k]·t[k] и M[k] должны быть близки, поэтому их разность отражает согласие модели и опытных данных. Решением называется набор из нескольких интенсивностей связывания промоторов и сайтов терминации, а также вероятностей терминации в обоих направлениях на каждом сайте; такие наборы задаются для нескольких последовательных моментов времени в развитии организма. Каждое решение определяет в модели свои уровни транскрипции всех генов. Нами принимается: если полимераза проходит через сайт связывания белка, то белок покидает сайт и затем присоединяется к нему в соответствии интенсивностью его связывания. Ищутся решения, для которых относительные уровни транскрипции, полученные при моделировании и в опыте, как можно более близки, т.е. минимизируется функционал, имеющий смысл штрафа и равный сумме слагаемых вида:  .
При этом учитывается и другая биологическая информация: например, транскрипция мРНК, кодирующей белок, происходит не реже двух раз за время ее полураспада, которое измерено у человека [Piechota et al., 2006] и крысы [Enríquez et al. 1999]. Модель реализована программой для многопроцессорной вычислительной системы. Программа доступна по адресу http://lab6.iitp.ru/ru/rivals/ и снабжена полным и подробным описанием, включая примеры моделирования. Там же доступен вариант этой программы для персонального компьютера, который позволяет следить за ходом моделирования в наглядном графическом режиме. Вычисления проводились на суперкомпьютере МВС-100К Межведомственного Суперкомпьютерного Центра РАН с привлечением 2048 процессоров.
Asin-Cayuela J., Gustafsson C.M. Mitochondrial transcription and its regulation in mammalian cells // Trends in Biochemical Sciences. 2007. 32(3). 111-117. Gelfand R., Attardi G. Synthesis and turnover of mitochondrial ribonucleic acid in HeLa cells: the matureribosomal and messenger ribonucleic acid species are metabolically unstable // Mol Cell Biol. 1981. 1. 497-511. Piechota J., Tomecki R., Gewartowski K., et al. Differential stability of mitochondrial mRNA in HeLa cells // Acta Biochim Pol. 2006. 3. 157-168. Enríquez J. A., Fernández-Silva P., Garrido-Pérez N., López-Pérez M.J., Pérez-Martos A., Montoya J. Direct regulation of mitochondrial RNA synthesis by thyroid hormone // Mol. Cell. Biol. 1999. 19(1). 657-670. Chang D.D., Clayton D.A. Precise identification of individual promoters for transcription of each strand of human mitochondrial DNA // Cell. 1984. 36(3). 635-643. Bogenhagen D.F., Applegate E.F., Yoza B.K. Identification of a promoter for transcription of the heavy strand of human mtDNA: In vitro transcription and deletion mutagenesis // Cell. 1984, 36(4). 1105-1113. Martin M., Cho J., Cesare A.J., Griffith J.D., Attardi G. Termination factor-mediated DNA loop between termination and initiation sites drives mitochondrial rRNA synthesis // Cell. 2005. 123(7). 1227-1240. Bogenhagen D.F., Yoza B.K. Accurate in vitro transcription of Xenopus laevis mitochondrial DNA from two bidirectional promoters // Molecular and Cellular Biology. 1986. 6(7). 2543-2550. Bogenhagen D.F., Yoza B.K., Cairns S.S. Identification of initiation sites for transcription of Xenopus laevis mitochondrial DNA // The Journal of Biological Chemistry. 1986. 261(18). 8488-8494. Bogenhagen D.F., Romanelli M.F. Template sequences required for transcription of Xenopus laevis mitochondrial DNA from two bidirectional promoters // Molecular and Cellular Biology. 1988. 8(7). 2917-2924. Ammini C.V., Hauswirth W.W. Mitochondrial gene expression is regulated at the level of transcription during early embryogenesis of Xenopus laevis // The Journal of Biological Chemistry. 1999. 274(10). 6265-6271. Chomyn A., et al. MELAS mutation in mtDNA binding site for transcription termination factor causes defects in protein synthesis and in respiration but no change in levels of upstream and downstream mature transcripts // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. 89. 4221-4225. Valverde J.R., Marco R., Garesse R. A conserved heptamer motif for ribosomal RNA transcription termination in animal mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. 91(12). 5368-5371. Wanrooij P.H., Uhler J.P., Simonsson T., Falkenberg M., Gustafsson C.M. G-quadruplex structures in RNA stimulate mitochondrial transcription termination and primer formation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2010. Fernández-Vizarra E., Enríquez J.A., Pérez-Martos A., Montoya J., Fernández-Silva P. Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis // Mitochondrion. 2011. 11. 207-213. Эволюция РНК-полимераз и их промоторов в пластидах А.В. Селиверстов, В.А. Любецкий (ИППИ РАН) РНК-полимеразы бактериального типа у споровиков. В ядерном геноме Toxoplasma gondii обнаружен только один ген, кодирующий σ-субъединицу РНК-полимеразы. Ее длина – 1002 аминокислотных остатков у штаммов ME49 и GT1, 1001 у штамма VEG. Ниже рассматривается белок XP_002367841.1 штамма ME49. В ядерном геноме Neospora caninum Liverpool ген CBZ51366.1 кодирует σ-субъединицу РНК-полимеразы длиной 1206 аминокислотных остатков. C-концы σ-субъединиц РНК-полимераз у T. gondii и N. caninum чрезвычайно близки друг к другу. Однако они не имеют существенного сходства с σ-субъединицами ни диатомовых водорослей Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1 и Thalassiosira pseudonana CCMP1335, ни золотистой водоросли Aureococcus anophagefferens, ни криптофитовых водорослей Guillardia theta и Hemiselmis andersenii. У кокцидий σ-субъединицы, ближайшие к этим σ-субъединицам, найдены у цианобактерий Cyanothece sp. PCC 7822 (YP_003885480.1), Microcoleus chthonoplastes PCC 7420 (ZP_05024793.1), Acaryochloris marina MBIC11017 (YP_001519047.1) и у δ-протеобактерии Desulfarculus baarsii DSM 2075 (YP_003809216.1). Бактериальные ортологи имеют длины от 260 до 363 аминокислотных остатков. У всех видов хорошо выравниваются C-концы второго региона, весь третий регион и N-концы четвертого региона σ-субъединиц РНК-полимераз. По всей длине четвертый регион выравнивается у T. gondii, N. caninum и D. baarsii. Также ортологи σ-субъединиц РНК-полимеразы найдены у простейших из отряда Haemosporida: Plasmodium berghei (XM_669238.1), Pl. falciparum 3D7 (XP_966194.1), Pl. knowlesi H (XM_002261430.1), Pl. vivax SaI-1 (XP_001616222.1), Pl. yoelii 17XNL (XP_724777.1), Pl. chabaudi (XM_739944.1). В каждом из них отсутствуют другие σ-субъединицы. Не удалось определить σ-субъединицы РНК-полимеразы у видов из отряда Piroplasmida: Theileria parva, Th. annulata, Babesia bovis. Особенностью пластомов споровиков является отсутствие в них α-субъединиц РНК-полимераз бактериального типа. Мы рассмотрели три вида кокцидий: Eimeria tenella, Toxoplasma gondii и Neospora caninum Liverpool. У T. gondii ME49 α-субъединица кодируется в ядре, соответствующий белок XP_002367289.1 имеет 836 аминокислотных остатков. В этом белке имеется отличие в одной позиции между штаммами T. gondii ME49 и GT1. В ядерном геноме E. tenella обнаружена близкая (E=1.1e-71) α-субъединица, для которой определены фрагменты четырёх экзонов на контиге dev_EIMER_contig_00028796 с координатами соответственно 5283..5453, 5682..6167, 6576..6785 и 7273..7965. В ядерном геноме N. caninum обнаружена близкая (E=9.9e-288) α-субъединица, для которой определены два экзона на контиге Contig892 с координатами соответственно 45655..47412 и 47940..48611. Следующее дерево σ-субъединиц РНК-полимераз бактериального типа у споровиков хорошо согласуется как с деревом видов, так и с деревом РНК-полимераз фагового типа: 
Существование не более одной σ-субъединицы РНК-полимеразы у споровиков указывает на незначительную роль регуляции пластома на уровне транскрипции. Вероятно, наибольшее значение имеет регуляция на уровне трансляции или процессинга, что подтверждается наблюдениями. Напротив, отсутствие в геномах некоторых субъединиц РНК-полимераз бактериального типа у Piroplasmida (Theileria parva, Th. annulata, Babesia bovis) и значительная фрагментация и точечные мутации в тех субъединицах, которые кодируются в пластоме, позволяет предположить исключительную транскрипцию всего пластома РНК-полимеразами фагового типа. Отсюда можно думать о полной неэффективности в борьбе с Piroplasmida антибиотиков, ингибирующих РНК-полимеразу бактериального типа. Напротив, такие антибиотики могут быть применены против Plasmodium spp, T. gondii и Neospora caninum. Роль РНК-полимераз бактериального типа для Eimeria tenella остаётся неясной из-за неполноты данных о ядерном геноме. Промоторы в пластидах кокцидий. Наличие единственной σ-субъединицы РНК-полимеразы у T. gondii позволяет думать, что все промоторы бактериального типа у T. gondii близки к одному консенсусу. Наличие консервативного четвертого региона у σ-субъединиц РНК-полимераз подтверждает существенную роль -35 бокса промотора, а высокая консервативность третьего бокса подтверждает важность TG-расширения -10 бокса промотора. Вместе с предсказанием большого числа промоторов перед интенсивно транскрибируемыми генами это позволяет считать, что оптимальный промотор близок к таковому перед геном psbA у горчицы. Наши результаты позволяют предполагать качественные различия между E. tenella и T. gondii в наборе РНК-полимераз и в составе соответствующих промоторов у пластид. В отличие от T. gondii, у E. tenella не найдено хороших промоторов бактериального типа, обеспечивающих интенсивную транскрипцию 26S рРНК и некоторых тРНК. Последнее позволяет думать, что в транскрипции этих генов основную роль играют необычные σ-субъединицы или РНК-полимеразы фагового типа, как у гена rpoB в пластидах цветковых растений. В случае участия РНК-полимераз фагового типа непродолжительное воздействие антибиотиков, блокирующих РНК-полимеразы бактериального типа, E. tenella может сохранять пластиды. РНК-полимеразы фагового типа у споровиков. У штаммов T. gondii ME49 (XP_002367014.1), T. gondii VEG (EEE31947.1), T. gondii GT1 (EEE23737.1) и у N. caninum (CBZ55882.1) найдено по одному экземпляру РНК-полимеразы фагового типа с номерами, указанными в скобках. При этом белки у штаммов T. gondii ME49 и VEG совпадают, а у штамма GT1 имеются замены аминокислотных остатков в нескольких позициях и вставка в позициях от 347 до 354. У E. tenella определить РНК-полимеразу фагового типа не удалось. Гомологи РНК-полимераз фагового типа найдены у многих споровиков, не являющихся кокцидиями: Plasmodium berghei (XP_676913.1), Pl. falciparum 3D7 (XP_001347935.1), Pl. knowlesi H (XP_002259256.1), Pl. vivax SaI-1 (XP_001615369.1), Pl. yoelii 17XNL (XP_727223.1), Pl. chabaudi (XP_739650), Babesia bovis T2Bo (XP_001611431.1), Theileria annulata (XP_953797.1), Theileria parva strain Muguga (XP_766496.1). Однако ортологичный белок не найден у кокцидии Cryptosporidium parvum, которая в отличие от многих споровиков не имеет пластид. Дерево РНК-полимераз фагового типа у простейших надтипа Alveolata: 
РНК-полимеразы фагового типа у видов рода Plasmodium хорошо выравниваются между собой, образуя кладу на дереве белков. Также отдельные клады формируют белки из Piroplasmida и Coccidia. Однако РНК-полимеразы Coccidia существенно отличаются от ортологичных белков других споровиков. Напротив, РНК-полимеразы фагового типа у кокцидий близки к ортологичным белкам тетрахимены, не имеющей пластид. Можно предположить, что у кокцидий РНК-полимеразы фагового типа не играют роли в транскрипции пластома. Наши данные не выявили значительного разнообразия РНК-полимераз фагового типа у простейших. Вероятно, РНК-полимеразы споровиков имеют древнее происхождение и не связаны с приобретением пластид. Напротив, у высших растений наблюдается большое разнообразие РНК-полимераз фагового типа, которые нацелены на различные органеллы. РНК-полимеразы бактериального типа у водорослей. У диатомовых водорослей найдены четыре σ-субъединицы: ThSig1a, ThSig1b, ThSig2 и ThSig3; среди них ближайшие паралоги ThSig1a и ThSig1b. Эти σ-субъединицы совместно присутствуют только у Thalassiosira pseudonana. У Phaeodactulum tricornutum отсутствует ортолог для ThSig1a, но найдены ортологи для ThSig1b, ThSig2, ThSig3. Близкие гомологи к ThSig1a,b найдены у бурой (Ectocarpus siliculosus) и золотисто-бурой (Heterosigma akashiwo) водорослей. У криптофитовых водорослей и багрянок белки ортологичные к ThSig1a,b отсутствуют. Белок ThSig2 ортологичен σ-субъединицам криптофитовых водорослей: одной у Hemiselmis andersenii и двум очень близким паралогам (из которых только один кодируется в нуклеоморфе) у Guillardia theta. Белок ThSig3 ортологичен σ-субъединицам багрянок. У багрянок имеется много близких паралогов σ-субъединиц; в частности, у Cyanidium caldarium их найдено пять, из них SigB и SigC отличаются заменами аминокислот только в одиннадцати позициях: 16, 44, 55, 94, 135, 136, 145, 164, 169, 300, 312. У E. siliculosus, кроме упомянутых, имеются еще две σ-субъединицы, далёкие от всех других σ-субъединиц. У большинства споровиков найдено по одной σ-субъединице. Класс Glaucocystophyceae. σ-Субъединицы SigA и SigB из C. paradoxa значительно различаются между собой, особенно на N-конце, хотя имеют несколько консервативных участков; первая близка к ThSig2 у диатомовых водорослей, а вторая существенно отличается от σ-субъединиц всех водорослей. У Bigelowiella natans и у большинства зелёных водорослей группы Chlorophyta найдено лишь по одной σ-субъединице; исключениями являются Micromonas pusilla и Chlorella variabilis, имеющие по две σ-субъединицы, которые в каждом из этих видов близки друг другу. Это позволяет предположить их независимое и недавнее возникновение в результате дупликаций. Также исследованы промоторы в пластидах диатомовых водорослей. У диатомовых водорослей и видов с близкими пластомами перед некоторыми генами, включая psaA, промоторы имеют два нуклеотида G в составе -35 бокса, что противоречит как бактериальному, так и другому характерному для этих видов консенсусу. Можно предположить, что этот промотор специфичен для одной из найденных нами σ-субъединиц ThSig1a, ThSig1b, ThSig2 и ThSig3. Предсказание промоторов бактериального типа в пластидах у водорослей. При поиске промоторов сначала отбирались участки вида YTG-(20..22N)-TA-(7..13N)-R. Затем эти участки сортировались по интенсивности связывания РНК-полимеразы с Sig1, предсказанной на основе данных о влиянии мутаций в промоторе перед геном psbA в хлоропластах горчицы. Рассмотрены потенциальные промоторы бактериального типа в пластидах с интенсивностью инициации транскрипции не ниже 20% от оптимальной для Sig1 из горчицы. У близких видов числа предсказанных промоторов близки, хотя между далекими видами они сильно различаются. Небольшое число промоторов у нефотосинтезирующей криптофитовой водоросли Cryptomonas paramecium с сильно редуцированным геномом и у фотосинтезирующих золотистых (Aureococcus anophagefferens, Aureoumbra lagunensis), желто-зеленых (Vaucheria litorea) и у видов Chromerida. Наименьшее – всего 15 промоторов – у Alveolata sp. CCMP3155. Сравнительно низкое число предсказанных промоторов у диатомовых, золотистых и бурых водорослей можно объяснить разнообразием σ-субъединиц и соответствующих промоторов, которые не были учтены. Напротив, у Heterosigma akashiwo найдена только одна σ-субъединица и для нее предсказано наибольшее число промоторов (103), больше чем для багрянок. Вероятно, отсутствие у H. akashiwo минорных σ-субъединиц привело к стабилизации всех промоторов вблизи одного консенсуса. Напротив, относительно малое количество предсказанных промоторов у криптофитовых водорослей объяснимо значительным отличием аминокислотных последовательностей их σ-субъединиц от таковых у других водорослей с пластидами, близкими багрянкам, включая H. akashiwo. Распределение потенциальных промоторов бактериального типа в пластидах некоторых водорослей с интенсивностью инициации транскрипции не ниже 20% от оптимальной для Sig1 из горчицы показано в следующей таблице:
жүктеу/скачать 2.44 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|