7-aad viability Dye Раствор для выявления жизнеспособных клеток каталожный номер im3422



жүктеу 101.5 Kb.
Дата17.06.2016
өлшемі101.5 Kb.

7-AAD Viability Dye

Раствор для выявления жизнеспособных клеток
КАТАЛОЖНЫЙ НОМЕР IM3422

150 тестов; 3 мл

20 мкл / тест








Спецификации готового к использованию лизирующего реагента OptiLyse B

Состав

Очищенный 7-амино актиномицин Д, разведенный в буферном растворе 0.008 M фосфат натрия, 0.15М хлорид натрия, pH 7.2, с 1% диметилсульфоксидом (ДМСО)

Объем

3 мл

Количество
флаконов


1 флакон

Объем для одного исследования

20 мкл / тест

НАЗНАЧЕНИЕ

Данный реагент предназначен для отделенияф жизнеспособных клеток пробы от мертвых с перфорированной мембраной в методе проточной цитометрии. Реагент используется после окрашивания лейкоцитов флуоресцирующими антителами. «7-AAD» р-р используется только в системах Beckman Coulter, при этом отмывка образца не выполняется при условии использования надлежащим образом откалиброванного проточного цитометра.


ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ

Биологические образцы инкубируются с раствором «7-AAD», что приводит к заполнению лейкоцитов с перфорированной мембраной (мертвых клеток) 7-амино актиномицином, что меняет светооптические характеристики этих клеток и дифференцирует их от жизнеспособных лейкоцитов с целой клеточной мембраной.

В пробе должны быть лизированы эритроциты путем инкубации с лизирующим раствором. В дальнейшем лейкоциты анализируются на проточном цитофлуориметре.

Подготовленный образец необходимо хранить при температуре 2 - 8°C, анализ следует выполнять вскоре после подготовки. Отмывка образца не требуется.

Проточный цитометр измеряет светорассеяние и флуоресценцию клеток. Он позволяет выделить интересующую популяцию на диаграмме, отображающей светорассеяние в боковом направлении (Side Scatter или SS) и светорассеяние в прямом направлении под малыми углами (Forward Scatter или FS). Для выбора анализируемых популяций в различных приложениях можно использовать другие двупараметровые диаграммы.

Прибор выполняет также анализ флуоресценции выбранной популяции. Результат представляется в виде процентного содержания положительных клеток от всех клеток выбранной популяции.


ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ

Реагент «7-AAD» хранится при температуре 18 - 25°C.

Стабильность нераспечатанного реагента приводится на этикетке флакона.

Стабильность распечатанного реагента 90 дней.


ВНИМАНИЕ

  1. Не используйте реагент с истекшим сроком годности.

  2. Не храните в холодильнике и не замораживайте реагент.

  3. Воздействие света в ходе инкубации необходимо свести к минимуму.

  4. Избегайте контаминации микроорганизмами, в противном случае возможно получение недостоверных результатов.



  1. Все образцы крови следует рассматривать как потенциально инфицированные. При работе с ними необходимо соблюдать все меры предосторожности (в частности, использовать защитные перчатки, халат и очки).

  2. После завершения работы пробирки с кровью и все одноразовые материалы необходимо поместить в специальные контейнеры для утилизации.


ОБРАЗЦЫ

Венозную кровь или образцы костного мозга необходимо отобрать в стерильные пробирки с солью EDTA, цитратом декстрозы (ACD) или гепарином в качестве антикоагулянта.

Образцы должны храниться при комнатной температуре (18 – 25°C). Встряхивание образцов не допускается. Перед отбором аликвоты образец следует гомогенизировать, аккуратно перемешав.

Анализ образцов необходимо выполнить в течение 24 часов после отбора.


МЕТОДИКА

НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ МАТЕРИАЛЫ

  • Пробирки и материалы для отбора проб. Автоматические пипетки с одноразовыми наконечниками на 20, 100, 500 и 1000 мкл.

  • Пластиковые пробирки для гемолиза.

  • Калибровочные частицы: флуоросферы Flow-Set™ (кат. № 6607007).

  • Специфические флуоресцирующие антитела.

  • Изотипические контроли.

  • Буфер (PBS: 0.01 M фосфат натрия; 0.145 M хлорид натрия; pH 7.2).

  • Реагент для лизиса эритроцитов . Например: Optilyse B (кат. № IM1400).

  • Центрифуга.

  • Миксер (вортекс).

  • Проточный цитофлуориметр.


ПОДГОТОВКА ПРОБ

Концентрация лейкоцитов в образце должна быть меньше 104 клеток/мкл (1010/л). При необходимости разведите образец PBS до концентрации лейкоцитов 5 x 103 / мкл (5 x 109/л).

Концентрация эритроцитов в образце должна быть меньше 6 x 106/мкл (6 x 1012/л), рекомендуется развести образец PBS до концентрации эритроцитов 5 x 106/мкл.

При коррекции концентрации как лейкоцитов, так и эритроцитов необходимо использовать большее разведение. Для анализа в пробирку отбирается 100 мкл как разведенного, так и неразведенного образца.



ПРОЦЕДУРА ПОДГОТОВКИ ПРОБ

Подготовка реагента

Подготовка не требуется. Используйте раствор «7-AAD» непосредственно из флакона.



Процедура

При исследовании любого образца необходимо также проанализировать контрольный образец (исследуемый образец плюс изотипический контроль, соответствующий специфическому окрашиванию).



ЗАМЕЧАНИЕ: Процедура окрашивания и лизиса без отмывки, описанная в пунктах 1-9, применяется при использовании надлежащим образом откалиброванных флуоресцирующих антител.

  1. В пробирки для анализа клинических образцов добавьте рекомендованное производителем количество конъюгатов антител, необходимых для окрашивания 5 x 105 лейкоцитов.

  2. В пробирки для анализа контролей добавьте рекомендованный производителем объем изотипического контроля, необходимый для окрашивания 5 x 105 лейкоцитов.

  3. В пробирки для анализа образцов и для анализа изотипических контролей добавьте по 100 мкл образца (разведенного или неразведенного). Аккуратно перемешайте на вортексе.

  4. Инкубируйте в соответствии с указаниями инструкции к используемым антителам.

  5. Добавьте 0.5 мл реагента OptiLyse B и немедленно перемешайте на вортексе в течение 1 секунды.

  6. Инкубируйте по меньшей мере 10 минут при комнатной температуре (18 – 25°C) в защищенном от света месте.

  7. Добавьте 0.5 мл PBS. Перемешайте на вортексе.

  8. Инкубируйте по меньшей мере 5 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте.

  9. Проанализируйте образцы в проточном
    цитофлуориметре.

ЗАМЕЧАНИЕ: Если требуется выполнить отмывку, перед анализом выполните шаги 10 и 11.

  1. Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g при комнатной температуре.

  2. Удалите супернатант аспирацией. Ресуспендируйте осадок клеток в 0.5 или 1 мл PBS с 0.1% раствором формальдегида.

Данный раствор можно также получить разведением 12.5 мкл реагента IOTest 3 Fixative Solution (кат. № A07800) в 10-кратной концентрации в 1 мл PBS.
ЗАМЕЧАНИЕ: Независимо от способа подготовки, подготовленные пробы необходимо хранить при температуре 2 - 8°C в защищенном от света месте. Анализ следует провести в течение 24 часов.

СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ЧИСТОТА И ВЫХОД ЛИМФОЦИТОВ

Чистота и выход лимфоцитов оценивались в соответствии с рекомендациями Центров по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) (1). Образцы крови 10 здоровых доноров были отобраны с использованием K3EDTA и помечены смесью моноклональных антител CD45-FITC и CD14-PE, откалиброванных для выполнения безотмывочного окрашивания и лизиса. В следующей таблице приводятся средние значения выхода и чистоты лимфоцитов, а также диапазоны значений:




Выход (%)

Чистота (%)

96.8

94.8

96.2 / 97.3

94.3 / 95.1

ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ

В один день на одном цитометре определялась средняя интенсивность флуоресценции, СИФ (в процентах) CD45+CD14 лимфоцитов в одном образце (в цельной крови здорового донора). Измерение выполнялось 12 раз. Отмывка после окрашивания и лизиса не использовалась. Полученные результаты суммированы в следующей таблице:




Цельная кровь

Количество измерений

Среднее (%)

SD

CV (%)

CD45+CD14–лимфоциты (%)

12

99.9

0.04

0.0

CD45+CD14лимфоциты (СИФ)

12

30.78

0.28

0.9



МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ

В один день на двух цитометрах определялось процентное содержание и средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) CD45+CD14 лимфоцитов в одном образце (в цельной крови здорового донора). Измерение выполнялось 12 раз. Отмывка после окрашивания и лизиса не использовалась. Полученные результаты суммированы в следующих таблицах:


Цитометр # 1

Цельная кровь

Количество измерений

Среднее (%)

SD

CV (%)

CD45+CD14–лимфоциты (%)

12

99.9

0.04

0.0

CD45+CD14лимфоциты (СИФ)

12

30.78

0.28

0.9

итометр # 2



Цельная кровь

Количество измерений

Среднее (%)

SD

CV (%)

CD45+CD14–лимфоциты (%)

12

99.0

1.49

1.5

CD45+CD14лимфоциты (СИФ)

12

37.65

0.20

0.5



ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ

  1. При неправильной настройке цитофлуориметра, неверной компенсации флуоресценции и неправильном расположении регионов могут быть получены недостоверные результаты.

  2. Для получения точных и воспроизводимых результатов необходимо соблюдать все приведенные инструкции и следовать нормам лабораторной работы.

  3. При гиперлейкоцитозе разведите образец PBS так, чтобы получить примерную концентрацию лейкоцитов 5 x 109/л.

  4. При полиглобулинемии разведите образец PBS так, чтобы получить примерную концентрацию эритроцитов 5 x 1012/л.

  5. Перед использованием необходимо довести температуру реагента «7-AAD» до комнатной (18 - 25 С).

  6. Визуально проверьте эффективность лизиса. Если образцы мутные, а также в том случае, если на диаграмме светорассеяния заметно необычное распределение, возможно, произошел неполный лизис.

  7. Эритробласты могут лизироваться не полностью и появляться на диаграмме светорассеяния в зоне лейкоцитов.

  8. При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая почечная недостаточность или гемоглобинопатии, лизис эритроцитов может происходить медленно, не полностью или совсем не происходить. В этом случае перед окрашиванием рекомендуется выделить мононуклеарные клетки в градиенте плотности (например, фикола).



ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

В приложении приводится список литературы и примеры диаграмм.



ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ

Логотип Beckman Coulter, COULTER, EPICS, EXPO, Flow-Set, IOTest, System II, XL являются зарегистрированными торговыми знаками компании Beckman Coulter Inc.



ИЗГОТОВЛЕНО:

IMMUNOTECH S.A.

a Beckman Coulter Company

130 avenue de Lattre de Tassigny

B.P. 177 – 13276 Marseille Cedex 9

France


Отдел по работе с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
www.beckmancoulter.com






/




©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет