8 часть I. Мутагенез 11 Глава 1
Число устойчивых к фагу Т 1 мутантов
жүктеу/скачать 357.05 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Индивидуальные культуры Общая культура Номер
- Число устойчивых мутантов
- Среднее 11,3 Среднее
- Частота de novo мутаций.
Число устойчивых к фагу Т 1 мутантов E.coli в пробах из разных культур и из одной культуры (Luria, Delbruck, 1943)
Продолжение табл. 1.2
В случае адаптации дисперсия числа устойчивых клеток должна рав- няться их среднему числу, при спонтанном возникновении устойчивости — многократно превышать среднее, что проявилось в опыте с индивидуаль- ными культурами. Таким образом, в эксперименте Лурии и Дельбрюка с «индивидуальными» и «общими» культурами E.coli было получено убе- дительное доказательство в пользу гипотезы спонтанного мутирования. Оригинальный опыт Лурии — Дельбрюка был усовершенствован в 1952 г. супругами Дж. и Э. Ледерберг с помощью метода реплик. Его суть заключалась в том, что сначала бактерии разводили в питательной среде без фага, высевали на чашку с питательной средой, подращивали, потом с этой чашки делали отпечаток на стерильную ворсистую ткань, а затем с него делали отпечатки (реплики) на несколько чашек, содер- жащих высокую концентрацию фага Т1. После инкубации на каждой чашке-реплике появлялись по нескольку устойчивых к фагу мутантов, расположение которых было одинаковым на каждой из чашек-реплик (рис. 1.2). Рис. 1.2. Метод реплик Мутантные колонии располагаются в одних и тех же местах чашек-реплик. Треугольник у верхнего края чашки обозначает ее ориентацию Если бы устойчивость этих колоний к фагу Т1 была индуцирована у перепечатанных на чашку-реплику бактерий только после их контакта с фагом, то такой случайный процесс не мог бы дать одинаковое рас- положение колоний-мутантов на параллельных чашках-репликах. Тот факт, что любая колония, устойчивая к фагу, всегда появляется на па- раллельных чашках-репликах на одном и том же месте, может озна- чать, что на этом месте исходной чашки, с которой сделан отпечаток, уже существовал клон мутанта. Поскольку исходная чашка не содержала фагов, то и полученные результаты указывают на то, что устойчивость к фагу имеет спонтанное происхождение. Спонтанные мутации у человекаЧастота de novo мутаций. Частоты возникновения мутаций должны определяться в половых клетках. De novo мутация — это наследственное изменение, присутствующее у ребенка, но отсутствующее у родителей. Мутации возникают в половых клетках одного из родителей, и частота возникновения мутаций в половых клетках определяется как: μ = (число носителей de novo -мутаций)/(2´общее число детей). Перечисленные требования к определению частоты мутаций у чело- века указывают на приблизительность существующих оценок частоты мутаций, основанных главным образом на встречаемости моногенных заболеваний в популяции. Однако развитие новых технологий секве- нирования генома человека позволило приблизиться к решению этой проблемы. В 2012 г. в журнале Nature были опубликованы результаты пилотной фазы проекта «1000 геномов» (1000 Genomes Project); он выполняется консорциумом примерно из 75 университетов и компаний, а основной его целью является глубокое и полное исследование полиморфизма ДНК че- ловека в различных популяциях. Проект стартовал в 2008 г., планируется секвенировать 2500 геномов из 12 популяций с использованием различ- ных подходов, в том числе полногеномного секвенирования и глубокого секвенирования экзонов. К основным результатам проекта относится описание локализации, аллельных частот и структур гаплотипов (гаплотип — специфическое сочетание аллелей в генотипе) приблизительно для 15 миллионов SNP (единичных нуклеотидных замен), 1 миллиона коротких вставок и де- леций и 20 тысяч структурных вариаций генома. Более половины всех вариаций выявлены впервые. Кроме того, было рассчитано, что индиви- дуальные различия в кодирующих областях в сравнении с референсным геномом сводятся к 10–11 тысячам несинонимических SNP (приводят к замене аминокислоты в белке) и 10–12 тысячам синонимических SNP (не приводят к замене аминокислоты). По оценкам исследователей, геном каждого человека содержит в гетерозиготном состоянии 250–300 функ- ционально неактивных генов и 50–100 мутаций, связанных с наследст- венными заболеваниями. Полученные данные позволили оценить сте- пень расхождения между популяциями и влияние естественного отбора на геном. Использование семей дало также возможность оценить частоту возникновения мутаций de novo в половых клетках. В проекте при анализе полученных результатов анализировались следующие типы мутаций: Нуклеотидные замещения = Nucleotide substitutions Инсерции и делеции (индел) = Insertions & deletions (indel) ±1–1000 п. н. Транспозиции = Transpositions ±100–1000 п. н. Мутации, нарушающие копийность = Copy number variants, CNV ±1000–3´106 п. н. (не видны под микроскопом) Структурные хромосомные аберрации (> ± 3´106 п. н.) и численные хромосомные аберрации (трисомия и моносомия) не рассматривались. Для определения частоты нуклеотидных замещений, возникших de novo в половых клетках человека, было проведено секвенирование гено- мов 219 индивидов из 78 семей Исландии. Было показано, что ребенок рождается в среднем с 63,2 мутациями, которые не были обнаружены у родителей. Это означает, что частота возникновения de novo мутаций у ребенка составляет 1,20´10–8 на н., то есть примерно 1´10–8 на п. н. в каждом поколении. В геноме человека повторяющиеся последовательности делятся на: Минисателлиты с длиной повторов 10–60 п. н. и с числом повторов от 10 до 1 500 на локус. Микросателлиты с длиной повторов 2–6 п. н. и числом повторов 5–200 на локус. При изучении частоты изменений в 2 477 аутосомных микроса- теллитных локусах у членов 24 832 семей Исландии было обнаружено 1 953 de novo индел-мутаций, частота возникновения этих мутаций со- ставляла 3,31´10–4 на локус. Если пересчитать эту частоту на коли- чество микросателлитных локусов, то каждый ребенок нес примерно 1,6 de novo индел-мутаций. Это только по исследуемым 2 477 микроса- теллитным локусам. Если в геноме человека ~1000 минисателлитных и столько же микросателлитных локусов, то среднестатистический ре- бенок может нести по меньшей мере 10 de novo индел-мутаций. Следует отметить, что индел-мутации в структурных генах приводят к сдвигу рамки считывания. Работы в рамках проекта дали первые оценки частоты de novo транс- позиций, которая составила ~0,05 на геном. Только три транспозиции были обнаружены в генах. Ожидаемое число транспозиций в генах может быть более 130. Это свидетельствует о том, что подавляющее большинство транспозиций, затрагивающих структурные гены, убираются отбором до рождения ребенка. Мутации, нарушающие копийность (CNVs), занимают значитель- ную часть генома. Они, по последним оценкам, обнаружены более чем в 4 000 локусов хромосом человека и занимают приблизительно 20 % всего генома. Частоты возникновения de novo структурных хромосомных аберра- ций в половых клетках человека изучены недостаточно. Но мы можем судить о частотах их возникновения, используя частоты их встречаемости в популяциях (табл. 1.3). Таблица 1.3 жүктеу/скачать 357.05 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||