Биохимия пәні бойынша зертханалық жұмыстар орындауға арналған әдістемелік нұсқаулар
СҮТТЕГІ ФОЛИЙ ҚЫШҚЫЛЫНЫҢ МӨЛШЕРІН АНЫҚТАУ
жүктеу/скачать 0.8 Mb.
|
| СҮТТЕГІ ФОЛИЙ ҚЫШҚЫЛЫНЫҢ МӨЛШЕРІН АНЫҚТАУ
Құрал-жабдықтар, реактивтер. Фотоколориметр; термостат 40°С-қа; су моншасы; домалақ түпті колба (Вюрц); өлшегіш колба 25 мл-ге; химиялық құйғы; өлшегіш колбалар 100 мл (2 дана); тамшуырлар 1 мл (2 дана); цилиндрлер 25 және 100 мл-ге (4 дана); таза сүт; толуол; активтелген көмір; пенициллин пленкасы – протеолиттік ферменттер көзі ( тереңдік мицелий Penicillium ацетонмен кептіріліп, шлифті тығынмен жабылған шыны ыдыста сақталады); 2%-дық және 15%- дық күкірт қышқылы; 15%-дық натрий гидроксиді; 70%-дық этил спиртіндегі 3%-дық аммиак; 4%-дық калий перманганаты; 3%-дық сутегінің асқын тотығы; фолий қышқылының бастапқы стандартты ерітіндісі (20 мг перекристаллизацияланған фолий қышқылын 10%- дық натрий гидроксидінің 3 тамшысымен сілтілендірілген 100 мл. суда ерітеді; ерітіндіні холодильникте сақтайды, қоңыр шыны ыдыста; анализ жасардың алдында фолий қышқылының стандартты жұмысшы ерітіндісін бастапқы ерітіндіні 100 рет сұйылтып жасайды; 1 мл. жұмысшы стандартты ерітіндіде 2 мкг. фолий қышқылы болады). Колбаға 35 мл сүт, 45 мл су құйып, pH = 3,5 – 4,0 болғанша бірнеше тамшы 15%-дық күкірт қышқылының ерітіндісін тамызады. Колбаның ішіндегіні араластырады, кері ауа тоңазытқышын орнатып, қайнаған су моншасында 45 мин бойы қыздырады. Содан соң колбадағы сұйықты 32°С -қа дейін суытады, 15%-дық натрий гидроксидінің ерітіндісімен рН 4,5 – 5,0 дейін жеткізеді. Әрі қарай колбаға 10 мл судағы 200 мг пенициллин қабығын, 3 тамшы толуол құйып, жақсылап араластырады және 16-18 сағат бойы 30-40°С температурада ферменттейді. Осы уақыт аралығынан кейін колбаны бөлме температурасына дейін салқындатып, ішіндегіні қатпарлы сүзгі арқылы сүзеді. Сүзгідегі тұнбаны екі рет судың аздаған үлестерімен жуады. Алынған фильтраттың көлемін сумен 100 мл-ге жеткізеді. Конустық колбаға 50 мл фильтрат алып, оны 15%-дық күкірт қышқылының ерітіндісімен рН = 3 болғанша қышқылдандырады, 100 мг белсендетілген көмір себеді. Қоспаны 5 мин тартпа шкафтың астында араластыра отырып қайнатады, содан кейін кеуек шыны сүзгімен вакуумда сүзеді. Бунзен колбасын алмастырады, сол сүзгі арқылы фолий қышқылын көмірден шығарып алу үшін қайнауға дейін қыздырылған 70%-дық спирттегі 3%-дық аммиакты 5 рет өткізеді (элюациялау үшін барлығы 70 мл сұйық алады: бірінші рет – 20 мл., екінші және үшінші рет – 15 мл-ден, төртінші және бесінші рет - 10 мл-ден). Біріктірілген элюаттарды Вюрц колбасында 10-15 мл көлемге дейін қайта айдайды. Қалдықты 20 мл-лік өлшегіш колбаға аударып, 2%-дық күкірт қышқылының ерітіндісімен рН = 3 дейін қышқылдандырады да, тамшылатып 4%-дық калий перманганатының ерітіндісін 10 мин бойы жойылмай сақталатын қызғылт түс пайда болғанша қосады. Содан соң калий перманганатының артық мөлшерін аластату үшін тамшылатып 3%-дық сутегінің асқын тотығының ерітіндісін қосады және 15%-дық натрий гидроксидінің ерітіндісімен рН -ты 4,0 – 4,5 -ке дейін жеткізеді. Жалпы көлемді сумен 25 мл-ге жеткізеді. Сұйықты сүзеді және флюоресценцияның қарқындылығын 470 нм-де ЭФ - 3 флюорометрде анықтайды. Параллельді түрде фолий қышқылының стандартты ерітіндісінің, зерттелген ерітіндіні өңдегендей етіп өңдеген (бақылаулық тәжірибе) және өңделмеген стандартты ерітіндінің, флюоресценциясының қарқындылығын өлшейді. Фолий қышқылының мөлшері формула бойынша есептеледі: мұнда с – фолий қышқылының мөлшері (мкг/мл); А – зерттелуші ерітінді үшін флюорометр көрсеткіші; А1 - бақылау ерітіндісі үшін флюорометр көрсеткіші; А2 - фолий қышқылының стандартты ерітіндісі үшін флюорометр көрсеткіші; b - 1 мл стандартты ерітіндідегі фолий қышқылының мөлшері; а – сүттің массасы (г); V – адсорбцияға алынған фильтрат мөлшері (мл); V1 – анықтауға алынған ерітіндінің соңғы көлемі (мл); V0 – ерітіндіні сұйылтқаннан кейін гі гидролизаттың көлемі (мл). жүктеу/скачать 0.8 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|