Чайка владимир кириллович

печени необходимо для дифференцирования между симптоматиче­ским хроническим течением, хроническим персистирующим гепа­титом и хроническим активным гепатитом. Результаты скрининга на гепатит В у беременной могут указывать на то, что новорожден­ному необходимо как можно скорее после рождения ввести имму­ноглобулин и вакцину против гепатита В.

Существуют разнообразные тесты, применяемые при HBV-ин-фекции. В настоящее время в основном применяют серологические исследования крови (РИА или ИФА).

Диагностика вируса гепатита С также основывается на сероло­гическом исследовании крови. Маркерами вирусного гепатита С являются: антитела HCV и прямое обнаружение вируса гепатита С в сыворотке крови.

Для обнаружения антител HCV используют иммуноферментные технологии (ELISA). Недостатком данного метода является тот факт, что пациенты с HCV-инфекцией могут вырабатывать антите­ла до года. Кроме того, количество вырабатываемых организмом антител может быть незначительным и не обнаруживаться данным методом даже при наличии активной, инфекционной болезни. Результаты HCV, следовательно, должны интерпретироваться с учетом анамнеза и объективного статуса, а также результатов вспо­могательных лабораторных исследований.

Для подтверждения тест-положительных результатов иммуно-ферментного анализа используется рекомбинантный иммуноблот-метод (Western blot).

Наиболее специфическим диагностическим методом на сегод­няшний день является ПЦР, которая заключается в полимеразном цепном увеличении вирусного антигена в клинических экземпля­рах для его прямого обнаружения.

Вирусный гепатит Д (HDV)

Лабораторная диагностика HDV-инфекции обычно основывает­ся на определении антител в сыворотке пациента (анти-HDV). В острой фазе болезни специфический анти-HDV IgM может опреде­ляться, хотя IgM может оставаться в низких титрах в случаях пер-систирующей HDV-инфекции. Анти-HDV IgG появляются позже. Для определения антител в сыворотке применяется Western blot, методика которого более чувствительна, чем иммуноферментные

54

Глава 3

методы. В научно-исследовательских лабораториях используется метод молекулярной гибридизации, что позволяет обнаружить РНК HDV в клинических экземплярах. Следует отметить, что об­следованию на HDV подлежат пациенты с гепатитом В, поскольку HDV — маленькая круглая полоска РНК, которая связана со спе­цифическим антигеном (HDVAg), покрытым HbsAg.

Диагноз HEV-инфекции ставится на основании исключения другого инфекционного гепатита.

Вирус может быть обнаружен в жидкости везикул, спинномозго­вой жидкости (СМЖ) и тонких срезах инфицированных тканей на секции; у новорожденных — на коже, в полости рта, глотки, носо­вой полости, глаз и СМЖ. Достоверным методом лабораторной ди­агностики инфекции является культуральное выделение вируса. Однако для этого нужны специализированные микробиологичес­кие лаборатории.

Обнаружение антигенов ВПГ в биологических жидкостях или в клетках является прямым доказательством активной репликации вируса и, следовательно, однозначно подтверждает этиологию забо­левания. Для выявления антигенов ВПГ широко применяется ме­тод РИФ. Характеризуя метод РИФ, следует подчеркнуть как его преимущества (специфичность, экспресс-метод, доступность, невы­сокую стоимость), так и недостатки (относительно невысокую чув­ствительность, зависимость диагностической эффективности от стадии заболевания, высокий уровень субъективности при учете результата).

Цитоморфологические методы позволяют выявить индуциро­ванные вирусом морфологические изменения в клетках и тканях пораженных органов. Эти методы делятся на две группы: в одних используется световая, в других — электронная микроскопия. При использовании световой микроскопии в зонах поражения отмеча­ется типичный для герпеса метаморфоз клеток и ядер. К недостат­кам световой микроскопии следует отнести их неспецифичность, невозможность дифференцирования первичной инфекции от реци­дивирующей, невозможность дифференцирования типа ВПГ.

Электронно-микроскопическое исследование позволяет обнару­жить в биопробах характерные по морфологии частицы ВПГ. Огра-

55

Глава 3

ничениями при использовании электронно-микроскопических методов является их неспецифичность, невозможность дифферен­цирования первичной и рецидивирующей инфекции и типа ВПГ, труднодоступность оборудования и отсутствие подготовленного персонала. Новейшим методом диагностики генитального герпеса является метод ПЦР.

Для выявления антител к антигену ВПГ используют классичес­кие серологические методы, а также ИФА, чувствительность которого на 2-4 порядка выше по сравнению с классическими серо­логическими методами.

Обнаружение ВПГ-специфических IgM-антител в единичной пробе крови указывает на недавнюю первичную или текущую (рецидивирующую) инфекцию. Определение IgG ВПГ должно осуществляться одновременно с определением IgM, особенно для диагностики первичной инфекции. Однократно определенный повышенный титр специфических антител класса IgG ВПГ не яв­ляется диагностическим критерием острой фазы инфекции. Опре­деление IgG-антител необходимо проводить в парных сыворотках с интервалом не менее 10 дней. Сероконверсия в период между дву­мя пробами крови также свидетельствует о текущей инфекции.

Исследование же сыворотки новорожденных на антитела к ВПГ не информативно, поскольку невозможно интерпретировать факт обнаружения IgG-антител к ВПГ из-за присутствия материнских антител, прошедших через плаценту. В этом случае диагностичес­кую ценность приобретает определение специфических IgM-анти­тел в сыворотке новорожденного.

Подозрение на листериоз может возникнуть в тех случаях, ког­да беременные страдают атипичным лихорадочным состоянием, а также при преждевременных родах. Следует брать пробы влага­лищных секретов, мочи и крови для бактериологического анализа и посева. Для этих целей обычно требуются специальные среды.

В последние годы разработана методика фаготипирования, од­нако 36% штаммов являются нетипируемыми.

При гистологическом исследовании плаценты выявляются та­кие характерные изменения, как микроабсцессы диаметром до 10 мм, воспаление ворсин и пуповины, а также хориоамнионит.

Анализ материнской крови на наличие антител обычно бывает малоэффективным, но его можно применять для определения Listeria как вероятной причины недавнего выкидыша.

56

Глава 3

У новорожденных Listeria могут быть высеяны из прямой киш­ки, с поверхности кожи, из крови и спинномозговой жидкости. Возбудитель может быть также высеян из первых порций выделен­ного мекония. При окраске по Граму мазков желудочного аспирата, взятых у младенца при болезни с ранним началом, обычно обнару­живаются полиморфно-ядерные лейкоциты и грамположительные микроорганизмы.

Neisseria gonorhoeae

Диагноз гонореи может быть легко поставлен с помощью мето­дов культивирования возбудителя. В этих случаях следует брать материал из уретры, шейки матки и прямой кишки. Другие методы выявления возбудителя дают менее удовлетворительные результа­ты, а исследование крови совершенно не эффективно. Методы культивирования обладают высокой чувствительностью, но при этом требуется, чтобы забранный материал был направлен в лабо­раторию в соответствующих транспортных средах. Необходимо от­метить, что ни в одной транспортной среде гонококки полностью не сохраняются на протяжении более 24 часов. Культуральная иден­тификация возбудителя включает оксидазную реакцию и реакцию расщепления декстрозы. Преимуществом культурального метода обнаружения гонококка является возможность одновременно проводить определение антибиотикоустойчивости, поскольку в на­стоящее время у больных циркулируют штаммы, устойчивые к пенициллину и другим антибиотикам. Обнаружение гонококка по­средством выявления антигена с помощью ИФА или РИФ менее эффективно, чем культуральный метод. Окраска препаратов мети-леновым синим и по Граму имеет только указательный характер и не может использоваться для постановки диагноза. В последнее время для обнаружения Neisseria gonorrhoeae используют молеку-лярно-биологические методы — ПЦР и ЛЦР.

Клинические симптомы кори делают в большинстве случаев не­нужной лабораторную диагностику. Антитела, выявляемые при ИФА, увеличиваются по мере нарастания сыпи и достигают пика к десятому дню (около четырех недель после вакцинации).

IgM и IgG появляются одновременно, но IgM исчезает к 90-му дню от начала заболевания, a IgG снижаются к шестому ме­сяцу и остаются на стабильном уровне.

57

— Глава 3

Не существует традиционных методов исследования клеточных культур для парвовируса В19. Однако разработаны специальные методики, основанные на использовании первичных культур кле­ток-предшественников кроветворного ряда из костного мозга чело­века или печени плода. Однако эти методы применяются только при научных исследованиях. На практике используется метод ДНК-гибридизации, основанный на выделении нуклеиновых кис­лот. Для подтверждения тестов на вирус В19 могут применяться некоторые другие тесты. Надежным средством для обнаружения вируса является электронная микроскопия, поскольку при данной инфекции часто отмечается В19-виремия и достаточное количество частиц вируса может быть визуально определено при негативной окраске. Данный метод может быть использован для исследования тканей.

Для обнаружения антигена В19 используют ряд методов — в час­тности, реакцию встречного иммуноэлектрофореза и радиоимму-ноанализа. Реакция вируса В19 в тестах по определению антигена может быть снижена или блокирована за счет одновременного при­сутствия специфических антител в пробах сыворотки или тканей.

Наиболее широко используемыми тестами на IgM и IgG к В19 в настоящее время являются разные варианты радиоиммуноанали-за. Количественное определение IgM-антител к В19 необходимо для диагностики недавно развившейся инфекции. Количественные по­казатели IgG к В19 определяют в целях получения доказательства ранее перенесенной инфекции и наличия иммунитета.

Наиболее информативным диагностическим тестом является выявление IgM-антител к В19. Диагноз В19-инфекции при бере­менности должен основываться на обнаружении у матери IgM-антител к В19. Беременных женщин, которые имели контакт с больными, следует тестировать на IgM и IgG-антител к В19. Для вы­явления инфицированных эмбрионов применяются такие методы, как определение уровней сывороточного альфа-протеина, ультра­звуковая диагностика и исследование крови плода на IgM-анти-тела к В19. При выкидышах или гибели плода в результате материнской инфекции необходимо проводить исследование пла­центы и тканей плода на наличие В19.

Можно исследовать с помощью прямых тестов на обнаружение вируса В19 пуповинную кровь, глоточные мазки и другие пробы, взятые у новорожденного. Но очень часто имеют место отрицатель-

58

Глава 3

ные результаты. В этих случаях проводят исследование ребенка в возрасте 1 год. К этому времени титры антител, пассивно передан­ных плоду от матери, падают до невыявляемого уровня и при нали­чии инфекции определяются собственные антитела.

Весьма важно, чтобы беременные женщины с заболеваниями, похожими на краснуху или контактировавшие с такими больны­ми, были обследованы как можно быстрее. Материалом для иссле­дования является сыворотка крови.

Существует ряд методик выявления антител против вируса краснухи, которые позволяют проводить количественную оценку уровней антител и тем самым использовать ее для диагностики ин­фекции при нарастании титров антител. К методикам, чаще всего применяющимся для скрининга антител при краснухе, относятся радиальный гемолиз (РГ), иммуноферментный анализ (ИФА) и ла­текс-агглютинация (ЛА). Для выявления нарастания титров анти­тел часто применяют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и ИФА.

Серологическая диагностика краснухи может быть проведена путем обнаружения значительного подъема титров антител IgG (более чем в 4 раза) или выявления специфических IgM-антител к вирусу краснухи.

Существенный подъем титров антител может быть выявлен в те­чение первых 4-7 дней после появления симптомов, хотя иногда серологический ответ может задержаться до 10 дней. При обследо­вании беременной женщины важно подтвердить полученные результаты с помощью альтернативного метода (например, опреде­ление специфических IgM-антител или путем исследования второй пробы сыворотки).

Специфические IgM-антитела обычно обнаруживаются в тече­ние 6-8 недель после контакта, в отдельных случаях они могут быть выявлены к четвертой неделе после начала болезни.

Пренатальная диагностика имеет значение для решения вопро­са о том, произошло ли инфицирование плода. Теоретически име­ются три возможных метода постановки пренатального диагноза врожденной инфекции:

1. Обнаружение вируса, вирусных антигенов или нуклеиновой кислоты в биоптатах хориона.

59

— Глава 3

2. 
   Обнаружение вируса, вирусных антигенов или нуклеиновой кислоты в амниотической жидкости.
   
3. 
   Обнаружение специфических IgM-антител в крови плода, по­лученной при кордоцентезе.
   

Диагноз можно поставить на основании выделения вируса крас­нухи из глоточных мазков или мочи. При этом вирус обнаружива­ется у большинства новорожденных с врожденной инфекцией. Обнаружение специфических IgG-антител в период от 1 года до 2-х лет жизни ребенка указывает на вероятность врожденной ин­фекции, так как инфицирование детей краснухой в этом возрасте происходит довольно редко.

Материалом для исследования у беременной женщины может быть среднесуточная порция мочи, кровь, выделения из влагалища (заднего свода). У младенцев (при подозрении на инфицирование) материалом для исследования может быть кровь, желудочный ас­пират, мазок из уха, моча, пробы с других участков, спинномозго­вая жидкость.

Штаммы стрептококка группы В быстро и постоянно растут на средах, обогащенных глюкозой, кровью или сывороткой. К другим методам диагностики относится обнаружение антигена в крови, спинномозговой жидкости и моче. Имеется ряд наборов промыш­ленного производства, основанных на разнообразных иммунологи­ческих методах выявления стрептококкового антигена группы В. Точные данные о проценте ложноположительных и ложноотрица-тельных результатов у разных авторов варьируют, однако в целом эти тесты являются достаточно надежными. Особенно пригодны они в тех случаях, где высока вероятность их обнаружения. Как правило, методы обнаружения антигена — это экспресс-тесты, ко­торые занимают 30 минут. Многие современные полуавтоматичес­кие методы позволяют получить культуру грамположительных кокков во флаконе в течение суток. Обнаружение антигена груп­пы В во флаконе дает возможность быстро поставить ориентиро­вочный диагноз.

60

— Глава 3 —

Для установления диагноза сифилиса используют как бактерио-скопическое, так и серологическое исследование крови.

Наиболее убедительным доказательством трепонемной природы заболевания является прямая визуализация трепонемы. При пер­вичном сифилисе на бледную трепонему исследуют отделяемое эро-зивно-язвенных папулезных элементов в области половых органов, полости рта, в пунктате из регионарных лимфатических узлов. При вторичном сифилисе используется материал из различных поражений кожи и слизистых оболочек. Для диагностики врож­денного сифилиса может быть использована амниотическая жидкость. При отрицательных результатах микроскопическое ис­следование повторяют либо до обнаружения бледной трепонемы, либо до подтверждения диагноза результатами серологического ис­следования. В последнее время для обнаружения ДНК бледной тре­понемы применяют ПЦР.

Серологические исследования крови основаны на определении антител, которые вырабатываются при сифилисе и классифициро­ваны как неспецифические и специфические антитела против тре-понем.

Образование IgG-антител следует за выработкой IgM-антител и обычно достигает более высокого уровня. Хотя титры IgG-антител могут со временем снижаться, они персистируют в течение всей жизни пациента даже при адекватном лечении.

ло начато лечение. Данные уровни могут снижаться по мере про-грессирования инфекции до поздней стадии (даже при отсутствии терапии). Реинфекция приводит к увеличению титров антител.

Существует множество тестов для количественной оценки анти­тел против липидов. Тесты фиксации комплемента (например, ре­акция Вассермана) в настоящее время в мире применяются очень редко, так как они не имеют преимуществ по сравнению с совре­менными тестами флоккуляции, тестом Venereae Disease Research Laboratory (VDRL) или экспресс-тестом, основанным на микропре­ципитации с кардиолипиновым антигеном с плазмой крови (RPR), которые более простые, быстрые, а также дешевле в исполнении.

Скрининговые и подтверждающие тесты на сифилис представ­лены в таблице 3.1. Серологический скрининг проводится с помощью анализа крови, взятого в первый визит пациентки, с при­менением стандартных тестов — нетрепонемных, таких как VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) или RPR (Rapid Plasma Reagin). Эти тесты обнаруживают нетрепонемные антитела и явля­ются неспецифическими, поэтому все положительные или сомни­тельные результаты должны быть подтверждены с помощью специфических трепонемных тестов, таких как тест иммобилиза­ции Treponema pallidum (Treponemapallidum immobilization test — TPI) и реакция иммунофлюоресценции-абсорбции (FTA-ABS — fluorescent treponemal antibody absorption).

После того, как получен первичный положительный результат какого-либо теста по определению антилипидных антител, необхо­димо определить титры этих антител. Данные тесты обладают огра­ниченной специфичностью, но они пригодны для диагностики трепонемной инфекции, поскольку дают положительный результат в начальной стадии и являются достоверными маркерами активно­сти инфекционного процесса.

Достоверным способом оценки активности болезни является тест на IgM-антитела.

Кардиолипины широко распространены в природе, поэтому ан-тилипидные антитела не являются специфическими при трепонем­ной инфекции: позитивные результаты могут наблюдаться при других заболеваниях, а иногда и у здоровых людей.

В 1982 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) ре­комендовала применение двух тестов для скрининга на сифилис. Один из них предназначался для обнаружения липидного (VDRL), а второй — трепонемного антигена (RPR). Данная комбинация представляет собой оптимальный способ выявления всех стадий трепонемной инфекции — как леченной, так и не леченной. В то

62

Глава 3

Таблица 3.1. Серологические тесты, применяемые для диагностики и эффективности лечения сифилиса

Тест	Тип теста	Клиническое применение
Rapid plasma regain (RPR)	Нетрепонемный (неспе­цифический). Карточный тест Rapid plasma regain «на месте». Макроскопический тест, может быть использован в клиниках. Недорогой	Диагноз активности, применяется в скринин­ге и для диагностики ак­тивности заболевания. Количественный. Успешность лечения/ре-инфекция
Veneral Disease Research Laboratory (VDRL)	Нетрепонемный (неспе­цифический). Не является тестом «на месте». Более чувствительный, так как микроскопиро-вание позволяет опреде­лить флоккуляцию. Должен быть проведен в лаборатории	Диагноз активности, применяется в скринин­ге и для диагностики ак­тивности заболевания. Количественный. Успешность лечения /ре-инфекция
Тест микроагглю­тинации Т.pallidum (MHA-TP)	Трепонемный. Специфический. Не является тестом « на месте». Дорогой	Исключает ложнополо-жительные результаты нетрепонемных тестов «serofast» (+ на протя­жении жизни). Качественный тест
Флюоресцентный тест абсорбции ан­тител Т.pallidum (FTA-ABS)	Трепонемный. Специфический. Не является тестом «на месте». Дорогой	Исключает ложнополо-жительные результаты нетрепонемных тестов «serofast» (+ на протя­жении жизни). Качественный тест. IgM может быть поло­жительным на ранних стадиях сифилиса

63

Глава 3

же время тесты VDRL и RPR — взаимозаменяемые и оказываются недостаточными для выявления ранней первичной инфекции.

При подозрении на первичную инфекцию у беременной необхо­димо проводить определение FTA. Однако диагноз первичной инфекции в большинстве случаев можно поставить путем тщатель­ного клинического обследования, сбора анамнеза и темнопольной микроскопии материала, взятого из любых участков поражения. Тест FTA применяется также в качестве контрольного теста для подтверждения результатов, полученных при исследовании мате­риала каким-либо из скрининг-тестов.

Современные серологические методики непригодны для диагно­стики сифилиса у плода.

Имеющиеся у матери антилипидные и антитрепонемные анти­тела могут пассивно проходить через плаценту; следовательно, об­наружение антител в крови плода не обязательно подразумевает наличие инфекции. Поэтому, учитывая эффективность лечения ин­фекции у матери, следует ориентироваться именно на это лечение в сочетании с регулярными серологическими обследованиями ново­рожденного для подтверждения эффективности терапии.

Окончательный диагноз сифилиса у новорожденного может быть поставлен при выявлении возбудителя — обычно путем тем-нопольного микроскопического исследования материала, получен­ного из пораженных участков тела. Серологическая диагностика у младенцев проблематична, так как антилипидные и антитрепонем­ные антитела IgG-антитела, имеющиеся у матери, могут пассивно передаваться плоду через плаценту. Антитела, полученные от матери, могут персистировать у младенца в течение нескольких месяцев, но, как правило, исчезают к 6-месячному возрасту. Ново­рожденный может быть обследован на наличие IgM-антител. Мате­ринские IgM-антитела не проходят через плаценту, и позитивный результат в этом случае позволяет предположить врожденную ин­фекцию. Однако при этом могут наблюдаться как ложноположи-тельные, так и ложноотрицательные результаты, и младенцы с врожденной инфекцией могут не быть IgM-позитивными вплоть до 3-месячного возраста. Кроме того, инфицированные младенцы могут быть и серонегативными при рождении, если мать была инфи­цирована в третьем триместре беременности. Поэтому рекоменду­ется проводить повторный скрининг младенцев, подверженных риску инфекции, вплоть до 6-месячного возраста.

В постнеонатальном периоде и в раннем детском возрасте кли­нический диагноз врожденного сифилиса может быть подтвержден путем серологического обследования.

64

Глава 3

Материалом для исследования у беременной женщины являет­ся сыворотка крови. Диагноз основывается на определении специ­фических антител. Наиболее достоверным подходом в этом случае является выявление специфической IgG-сероконверсии (т. е. пере­ход отрицательных результатов исследования в положительные). Точно установленная IgG-сероконверсия может быть подтвержде­на выявлением специфических IgM-антител. В этом случае стано­вится очевидным, что речь идет об острой инфекции, создающей риск внутриутробной передачи токсоплазмоза.

Если серологические тесты в первом триместре беременности указывают на наличие инфекции у матери, необходимо обследо­вать плод с помощью ультразвуковой эхографии и кордоцентеза. В крови плода, полученной путем кордоцентеза, можно измерить уровень IgM-антител

Принятым «эталонным» методом для количественной оценки антител против токсоплазм является тест окрашивания. Ввиду технической сложности и высокой его стоимости, выполняется только в специализированных центрах. Традиционные варианты метода ELISA при количественном определении IgM-антител часто дают ложноположительные результаты, связанные с избытком специфических IgG-антител, и ложнопозитивные реакции, связан­ные с присутствием ревматоидного и антинуклеарного фактора в сыворотке.

У новорожденных с выраженными поражениями предположи­тельный диагноз может быть поставлен на основании клинических данных. При выделении паразита из ткани плаценты диагноз врожденной инфекции становится весьма вероятным, но и отрица­тельные результаты исследования не исключают такого диагноза. Выделение Т.gondii из крови новорожденного имеет диагностичес­кое значение, но, как и при культивировании ткани плаценты, отрицательные результаты могут быть получены при наличии врожденной инфекции, особенно если проводилось пренатальное лечение. Для выделения паразитов из крови плода требуется ускоренная и высокочувствительная методика. Заражение живот­ных является высокочувствительным методом, однако оконча­тельные результаты могут быть получены только через 45 дней. Более быстрым методом является выращивание токсоплазм в куль­туре ткани, но при этом не обеспечивается достаточный уровень чувствительности. Эти проблемы можно преодолеть с помощью мо­лекулярной биологии в целях обнаружения специфической ДНК.

65