Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись (см рис.6). Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно, перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей (см. рис.6). Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифичных продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 сек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой отжига выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки (см. рис. 6). Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5'- к 3'-концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато». [28]

Рисунок 6. Стадии ПЦР. 1 - Денатурация, 2 – Отжиг, 3-4 – Элонгация, Р – ДНК-зависимая ДНК полимераза.[29]

В дополнение к обычной ПЦР в середине 90-х годов XX века появилась также ПЦР «в реальном времени». Этот метод, в общем случае, подразумевает определение количества амплифицированной ДНК по уровню флуоресценции, возникающей в пробирке, которую в ходе реакции фиксирует детектирующий амплификатор ДНК (рис.7). Этот метод имеет ряд преимуществ. Во-первых, при нем не происходит открывания пробирки после реакции, что снижает вероятность загрязнения лаборатории продуктами реакции [Higuchi et al., 1992]. Во-вторых, есть несколько разных способов проявки продуктов реакции, например, способ с добавлением интеркалирующего красителя [Higuchi et al., 1993] или использование флуоресцентной метки на праймере или зонде [Christopher J. et al, 2005]. Применение же ПЦР «в реальном времени» на практике, наряду с ответом на вопрос о наличии или отсутствии в исследуемом образце мишени, позволяет оценить её количество [Ребриков и др., 2009].

Рисунок 7. Пример графиков накопления продукта реакции в ходе ПЦР «в реальном времени». Cp – номер цикла, нужный для сравнения количества выделенной ДНК между разными образцами. Fam, Hex – типы флюоресценции, считываемые прибором.

Работа: Fecal DNA analysis and risk assessment of mountain lion predation of bighorn sheep [Holly et al., 2002].

В этой работе были проанализированны образцы ДНК из фекалий горных львов (Puma concolor) с целью идентифицировать особей, охотящихся на редкого толсторогого барана (Ovis canadensis) в Калифорнии с 1993-1999 год. Были идентифицированы 18 горных львов.

Работа: Noninvasive monitoring of wolves at the edge of their distribution and the cost of their concervation [Echegaray et al., 2009].

В течение 2003-2004 года были собраны 136 фекалий, идентифицированных, как принадлежащие серым волкам за границей их привычного ареала обитания. В 86 случаях удалось генетически идентифицировать эти образцы, 31 – серые волки, 2 – красные лисы, 53 – собаки. Индивидуально были идентифицированны 16 разных волков по 20 микросателлитам.

Работа: Noninvasive methodology for sampling and extraction of DNA from free-ranging Atlantic spotted dolphins (Stenella frontalis) [Michelle et al., 2007]

Были собраны 15 образцов фекалий атлантических пятнистых дельфинов, которые были протестированы на пригодность к использованию в генетических исследованиях, включая ядерную и митохондриальную ДНК. Полученые митохондриальные сиквенсы были очень похожи на уже известные гаплотипы .Также были идентифицированы мать и детеныш как при помощи митохондриального гаплотипа, так и при помощи наследования алелей детеныша.

Работа: Noninvasive genotyping and mendelian analysis of microsatellites in African savannah elephants [Okello et al., 2005].

Были исследованы 202 (133 пары мать-детеныш) образца фекалий саванных слонов, которые были генотипированны по 20 микросателлитам.

1.6 Некоторые работы в области ДНК-идентификации представителей семейства кошачьих (Felidae)

Работа: In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger [Henry et al., 2009].

В этой работе описывается исследование генетической структуры и демографической истории группы амурских тигров и сравнение данных полученных в неволе и природе.

По результатам этой работы было установлено, что генетическая вариабельность в неволе и в природе одинакова, однако в неволе сохраняются те варианты генов, которые были утеряны в природе. Также, было найдено историческое сокращение численности популяции, хотя и не получилось доказать недавнее «бутылочное горлышко», а оценки численности были ниже всех, предложенных ранее.

Работа: A Genetic Linkage Map of Microsatellites in the Domestic Cat (Felis catus) [Menotti-Raymond et al., 1999].

В этой работе авторы провели генетическое картирование генома домашней кошки (Felis catus), в результате которого была составлена карта генетической связи в микросателлитных локусах, включающая 246 аутосомальных и 7 локусов, связанных с Х хромосомой. Было идентифицировано около 235 динуклеотидных и 18 тетрануклеотидных повторов, причем они были генотипированны в два семейства, включающих 108 членов, полученных при межвидовом обратном скрещивании родословных домашней кошки и бенгальской кошки. Также было получено 34 группы, идентифицирующихся несколькими маркерами, связанными с 229 локусами. Было выяснено при помощи соматического клеточного гибридного анализа, что представительные маркеры из каждой группы принадлежали к специальным хромосомам кошки. Был установлен приблизительный размер генома – 2900 сМ, а генетическая длинна усредненной половой карты – 3300 сМ.

Работа: Population size estimation of Amur tigers in Russian Far East using noninvasive genetic samples [Sugimoto et al., 2012].

В этой работе была произведена приблизительная оценка численности популяции и идентификации особей амурского тигра с помощью неинвазивных генетических образцов (шерсти, фекалий, слюны), собранных в Приморском Крае на протяжении четырех зим (2000–2001, 2001–2002, 2002–2003, и 2004–2005). В течение этих зим было идентифицированно 12 тигров (7 самок и 5самцов) при помощи 10 микросателлитных маккеров. Оценочна численность популяции составила 12 особей, что совпалоло с другими данными. Было установлено, что из неинвазивных генетических образцов самыми лучшими для генотипирования являютсяч фекалии.

Работа: Неинвазивная индивидуальная идентификация амурских тигров (Panthera Tigris altaica) молекулярно-генетическими методами [Рожнов и др., 2009].

В этой работе была успешно проверена методика неинвазивной индивидуальной идентификации тигров молекулярно-генетическими методами, и с ее использованием определены число, пол и родственные связи особей в группировке тигров на территории заповедника «Уссурийский» ДВО РАН. Сопоставление результатов выделения, амплификации и анализа ядерных фрагментов ДНК из различных образцов (кровь, шерсть и экскременты) показало значительное их сходство по длинам микросателлитных фрагментов ДНК. Это свидетельствует о возможности использования экскрементов и шерсти, собранных в местах обитания амурского тигра, для неинвазивной индивидуальной идентификации этих животных.

На момент начала нашей работы данных о существовании тест-систем для определения пола амурских тигров методом ПЦР «в реальном времени» и определения SNP в геноме амурских тигров методом ПЦР «в реальном времени» не обнаружено.

2 Материалы и методы

2.1 Образцы для исследования

Образцы для исследования были любезно предоставлены А. Субботиным и П. Сорокиным (Институт проблем экологии и эволюции им. Северцова, Москва).

В нашем распоряжении оказались образцы фекалий четырех тигров:

♀Барышня–Амурский тигр, г. Волгоград. г.р. 2007, собрано 17.12.2013;

♀Матрена–Амурский тигр, г. Волгоград. г.р. 2002, собрано 17.12.2013;

♂Зевс–Амурский тигр, г. Волгоград. г.р. 2002, собрано 17.12.2013;

♀Принцесса–Амурский тигр, Московский зоопарк, г.р. 2002.

Также, П. Сорокиным нам были любезно предоставлены образцы мышечной ткани двух самцов, убитых браконьерами на Амуре и 5 образцов ДНК разных амурских тигров (самцов и самок), выделенной из тигриных фекалий в лаборатории Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова, и в дальнейшем использованной в проверке тест-системы.

Российской академии наук (ИПЭЭ РАН).

2.2 Очистка ДНК из различного биологического материала тигра

Был использован коммерческий набор реагентов компании ДНК-Технология «Проба-ГС». В этом наборе для связывания ДНК используется силикатный сорбент. В пробирку вносят образец биологического материала, к нему добавляют лизирующий раствор и силикатный сорбент. Затем, путем нагревания, центрифугирования, использования промывочных и элюирующего раствора, получают очищенный препарат ДНК.

Примечание. В лизирующем растворе и в промывочном растворе №1 допускается выпадение осадка, перед началом работы его необходимо растворить нагреванием флакона при 50 °С в течение 15–20 мин.

1. 
   Промаркируйте для каждого исследуемого образца и отрицательного контрольного образца «К-» по одной пробирке объёмом 1,5 мл.
   
2. 
   Внесите по 50 мкл подготовленного биоматериала в пробирки для исследуемых образцов. В пробирку«К-» биоматериал не вносится.
   
3. 
   В пробирку, маркированную «К-», внесите 50 мкл физиологического раствора стерильного.
   
4. 
   Приготовьте смесь лизирующего раствора с сорбентом. Смешайте в отдельной пробирке:
   

• 
  150 х (N+1) мкл лизирующего раствора,
  
• 
  20 х (N+1) предварительно ресуспендированного сорбента,
  
• 
  где N + 1 – количество анализируемых образцов с учётом «K-» (N) с запасом на 1 образец.
  

5. 
   Добавьте в каждую пробирку по 170 мкл полученной смеси.
   
6. 
   Плотно закройте крышки пробирок, встряхните на вортексе в течение 3–5 сек.
   
7. 
   Термостатируйте пробирки в течение 20 мин при 50°С.
   
8. 
   Центрифугируйте пробирки при 13000 об/мин в течение 1 мин.
   
9. 
   Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки).
   
10. 
    Добавьте к осадку 200 мкл промывочного раствора №1 и встряхните пробирки на вортексе в течение 3–5 сек.
    
11. 
    Центрифугируйте пробирки при 13000 об/мин в течение 1 мин.
    
12. 
    Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки).
    
13. 
    Добавьте к осадку 200 мкл промывочного раствора №2 и встряхните пробирки на вортексе в течение 3–5 сек.
    
14. 
    Центрифугируйте пробирки при 13000 об/мин в течение 1 мин.
    
15. 
    Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки).
    
16. 
    Добавьте к осадку 200 мкл промывочного раствора №3 и встряхните пробирки на вортексе в течение 3–5 сек.
    
17. 
    Центрифугируйте пробирки при 13000 об/мин в течение 1 мин.
    
18. 
    Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки).
    
19. 
    Откройте крышки пробирок и высушите осадок при 50°С в течение 5 мин.
    
20. 
    Добавьте к осадку 50 мкл элюирующего раствора и встряхните пробирки на вортексе в течение 5–10 сек.
    
21. 
    Прогрейте пробирки при 50°С в течение 5 мин.
    
22. 
    Центрифугируйте пробирки при 13000 об/мин в течение 1 мин. Если образец предполагается хранить более 7 суток, перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку.
    

Полученный препарат ДНК можно хранить до 7 суток при температуре 2–8°С или до года при минус 20°С

Состав ПЦР-реакции:

1. 
   10-ти кратный ПЦР-буфер с Mg²⁺ (производства ДНК-Технология).
   
2. 
   Нуклеотиды 25 и 5 мкм/мл (производства ДНК-Технология).
   
3. 
   Taq-полимераза (производства ДНК-Технология).
   
4. 
   Праймеры (производства ДНК-Технология).
   
5. 
   Деионизованная вода (производства EMD Millipore , MilliQ).
   
6. 
   Зонд. (производства ДНК-Технология).
   
7. 
   Минеральное масло (производства Sigma).
   

Табл.1 Порядок и объем внесения реагентов в пробирку для «обычной» ПЦР

Программа ПЦР-амплификации

Рабочий объем смеси – 35мкл.

94,0°C – 10 сек

64,0°C – 20 сек (считывание флуоресценции) x 50 циклов

68,0°C – 10 сек

Этот метод основан на том, что ДНК, являясь сильно полярной молекулой, в электрическом поле будет двигаться в геле от анода к катоду.

Метод позволяет посмотреть прошла ли ПЦР, проверить правильность подобранных праймеров. Для начала делают агарозный гель. На 1 гр агарозы мы брали 5 мкл бромистого этидия, 100 мл буферного раствора TAE x 1, затем все это смешивают и доводят до кипения, дают немного остыть , после чего заливают в форму, в которой стояли гребенки (для лунок в геле). После 20 мин ожидания гель можно класть в камеру для электрофореза, в которой налит TAE x 1. Важно, чтобы буфер полностью закрывал гель. Далее ДНК после ПЦР разносят по лункам, смешивая методом пепетирования с краской, также наносим маркер (Geneladder 50). После заполнения нужных лунок, мы включаем источник постоянного тока (важно, чтобы прибор стабилизировался на напряжении), по прошествии 20-30 мин фиксируем результат. Фотофиксация результата происходит при помощи фотосистемы под действием ультрафиолета на гель.

2.5 Использованное программное обеспечение и программы

1. Для поиска праймеров использовали программу BLAST;

2. Для подборки последовательности олигонуклеотидов использовали Oligo 6.0

3. Для проведения ПЦР использовали программное обеспечение для ПЦР-амплификатора ДТ-322.

Если не указано отдельно, использованы химические реагенты производства Sigma-Aldrich (Германия). Синтез олигонуклеотидов выполнен компанией ДНК-Технология.

Для определения оптимального объема образца для получения достаточного количества ДНК наилучшего качества, был проведён эксперимент по оценке качества экстракции ДНК из разного количества фекалий тигра.

В экстракцию были взяты четыре разных количества фекалий: 5мкл, 25мкл, 125мкл, 300 мкл, от одного тигра (Амурский тигр Барышня, собрано 17.12.13) и проведено выделение ДНК при помощи набора реагентов «Проба-ГС» как описано в разделе «Материалы и методы».

Для каждого полученного таким образом препарата ДНК была проведена ПЦР «в реальном времени» с праймерами и зондами на Х и Y-хромосомы тигра (описание тест-системы см. ниже). Также были поставлены 2 контрольных образца: К+ – образец ДНК из мышечной ткани самца (всегда хорошо амплифицируется) и К-, где вместо ДНК была внесена вода MQ. Результаты эксперимента представлены на рисунке 8.

Рисунок 8. Протокол ПЦР реакции при оценке выделения ДНК. Подписаны пробирки с удавшейся ПЦР.

Как видно из протокола (рис.8), результат амплификации присутствует лишь в образце, полученном из 25 мкл фекалий. Отсутствие продукта ПЦР в образце из 5 мкл фекалий можно объяснить недостаточным количеством получаемой ДНК, а отсутствие продукта в образцах из 125 мкл и 300 мкл – слишком низкой степенью очистки нуклеиновых кислот и, как следствие, ингибированием ПЦР. Срабатывание системы Y1 на образце ДНК самки можно объяснить неспецифичной работой тест-системы (скорее всего амплифицируется гомологичный Y-хромосоме фрагмент Х-хромосомы).

По полученным кривым можно примерно оценить количество ДНК в образце после экстракции. Исходя из Ср около 28-29 (для лучше сработавшей системы Х1) и принимая, что ПЦР с одной молекулы как правило даёт Ср около 40-42, можно оценить количество молекул, попавших в ПЦР как 1000. С учётом того, что в реакцию брали 1/50 объема полученного препарата ДНК, общее количество молекул в образце после экстракции можно оценить как 5х10⁴.

Отдельно следует указать на проблему гетерогенности фекалий по содержанию ДНК. Этот вопрос достаточно хорошо проработан для образцов биологического материала человека (но можно предполагать, что ситуация аналогична и для фекалий тигра). Как известно из литературы, фекалии человека гетерогенны по содержанию ДНК, то есть ДНК человека распределена в структуре исходного биологического материала крайне неравномерно. Поэтому для получения воспроизводимых данных по количеству нуклеиновых кислот рекомендуется проводить гомогенизацию значительного (несколько миллилитров) препарата фекалий, после чего производят экстракцию ДНК из небольшого объема. Поскольку в нашем исследовании задача стабильного получения и оценки количества ДНК тигра из фекалий не ставилась, мы не прибегали к предварительной гомогенизации образца.

3.1.2 Подбор праймеров для специфичной наработки фрагментов Х и Y хромосом тигра

На момент начала исследования в базе данных присутствовал геном амурского тигра [30], но без указания хромосомной принадлежности последовательностей. Поэтому для обнаружения Х и Y- специфичных регионов нами было проведено сравнение генома тигра с геномом домашней кошки (для которой были данные по хромосомной принадлежности последовательностей). В результате были выбраны несколько регионов генома тигра, гомологичных Х или Y-хромосомам кошки.

Подбор праймеров осуществляли в программе Oligo 6.0, с учетом следующих требований:

1. 
   Длина 18-24 нуклеотида.
   
2. 
   Четыре и более 3’-концевых нуклеотида не должны быть комплиментарны самому праймеру, праймеру в паре, пробе или иным синтетическим олигонуклеотидам, добавляемым в реакцию.
   
3. 
   Температура отжига должна лежать в диапазоне 60-70˚С.
   
4. 
   Температура плавления праймеров, работающих в паре, для большинства приложений должна быть сходной.
   
5. 
   Желательно, чтобы температура плавления 5’- концевой части праймера была выше температуры плавления 3’- концевой части.