Проверка специфичности срабатывания праймеров на образцах ДНК самок и самцов тигра

Сперва были подобраны 4 системы праймеров: две на Х и две на Y хромосому тигра соответственно. По результатам проверки специфичности срабатывания тест-систем оказалось, что тест-системы на Y-хромосому не специфичны (рис.9, рис.10, рис.11), т.е. срабатывают на самках и самцах одинаково. В этой связи нами были подобраны дополнительно две тест-системы на Y хромосому (названия систем Y3 и Y4), последняя из которых показала специфичное срабатывание (рис.11). При постановке систем на Х хромосому, обе системы срабатывали, однако эффективность и специфичность праймеров Х1 была несколько выше, чем Х2 (рис.9, рис. 12).

Рисунок 9. Электрофореграмма результатов ПЦР с двумя образцами ДНК (M2 и M4-самцы) из мышечной ткани со всеми тест-системами (X1, X2, Y1, Y2, Y3, Y4). M50 – маркер длин, цифрами подписаны длины фрагментов в парах нуклеотидов.

Рисунок 10. Электрофореграмма результатов ПЦР с четырьмя образцами ДНК: Барышня (♀), Матрена (♀), Зевс (♂), М4 (♂) – образцы ДНК из фекалий, М4 – ДНК из мышечной ткани. Использовали 3 тест-системы: Х1, Y3, Y4. M50 – маркер длин, цифрами подписаны длины фрагментов в парах нуклеотидов.

Рисунок 11. Электрофореграмма результатов ПЦР с тремя парами праймеров (Х1, Y3, Y4) и четырьмя образцами ДНК (М1-♂, 001 -♀, Tg2–♀, 001m–♀). M50 – маркер длин, цифрами подписаны длины фрагментов в парах нуклеотидов.

На выбранные системы X1 и Y4 были подобраны проявляющие олигонуклеотидные зонды и проведена ПЦР «в реальном времени» (Рис.13, 14). Проверка показала, что выбранные зонды срабатывают достаточно хорошо.

Тест-система на Х хромосому работает чуть хуже, чем на Y, что позволяет в случае, когда срабатывает лишь Y, более уверенно говорить, что был проанализирован образец ДНК самца (см. рис 15).

Рисунок 13. Проведение ПЦР «в реальном времени» на образце ДНК самца амурского тигра. Как видно из графика, сработали обе тест-системы (Х1 и Y4).

Рисунок 14. Проведение ПЦР «в реальном времени» на образце ДНК самки амурского тигра. Как видно из графика, сработала только одна тест-система (на Х хромосму).

Рисунок 15. Проведение ПЦР «в реальном времени» на образцах ДНК двух самцов. Видно, что не прореагировала тест-система на Х-хромосому (возможно, вследствие малого количества стартовой ДНК).

Для создания тест-систем на SNP в геноме тигра нами были использованы данные анализа генома из работы Чо с соавторами (Cho et al, 2013). Поскольку в публикации отсутствовали данные о расположении SNP относительно хромосом (желательно было бы взять SNP, расположенные на разных хромосомах), для создания тест-систем были выбраны 4 случайных региона с SNP. На первых 4-х маркерах планировалось отработать систему заказа и проверки срабатывания тест-систем, после чего довести число маркеров до 20.

В программе Oligo 6.0 были подобраны олигонуклеотиды на предположительно вариабельные генетические маркеры (SNP). Для каждого региона были подобраны две пары праймеров, ограничивающих регион, включающий SNP, два олигонуклеотида с разными флуоресцентными метками (FAM и VIC) и один олигонуклеотид с гасителем флуоресценции (BHQ). В табл. 4 приведены выбранные последовательности олигонуклеотидов.

Таблица 4. Подобранные последовательности олигонуклеотидов SNP.

При проверке тест-систем, четкие графики были получены лишь для систем S1 и S2, которые и приведены ниже. По результатам эксперимента удалось генотипировать двух тигров (мышечная ткань, самцы) по однонуклеотидному полиморфизму. Совершенствование и создание следующих систем планируется в продолжении работы.

Рисунок 16. Анализ графиков, полученных при постановке SNP тест-систем (S2, самец1 (мышечная ткань))). Точки максимума находятся примерно на одном перпендикуляре, что говорит о равном С_р, а это значит, что праймеры отходили равномерно, следовательно данный тигр гетерозиготен.

Рисунок 17. Анализ графиков, полученных при постановке SNP тест-систем (S1, самец2 (мышечная ткань))). Точки максимума находятся не на одном перпендикуляре, что говорит о неравном Ср, а это значит, что праймеры отходили неравномерно, следовательно данный тигр гомозиготен.

1. 
   Оптимальным количеством фекалий тигра для экстракции ДНК набором «Проба-ГС» является 25 мкл материала. При этом получается около 50000 геном/эквивалентов на образец. Пригодным количеством мышечной ткани тигра на одну экстракцию набором «Проба-ГС» является 3 мм³ материала.
   
2. 
   Разработана тест-система для определения пола амурских тигров методом ПЦР «в реальном времени». Тест-система успешно срабатывает на образцах ДНК из фекалий и мышечной ткани.
   

Автор выражает благодарность П.А.Сорокину за предоставление образцов биологического материала для исследований и помощь в работе, а также А.Субботину за предоставление образцов биологического материала.

1. 
   Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семенов, А.М. Савилова, И.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов., ПЦР в реальном времени., Бином. Лаборатория знаний., 2009.
   
2. 
   В.В. Рожнов, П.А. Сорокин, С.В. Найденко, В.С. Лукаревский, Х.А. Эрнандес, М.Н. Литвинов, А.К. Котляр, В.Г. Юдин, Неинвазивная индивидуальная идентификация амурских тигров (Panthera Tigris altaica) молекулярно-генетическими методами, Доклады Академии Наук, том 429, №2, 2009, с. 278-282.
   
3. 
   В.Е.Соколов, М.С. Гиляров, Ю.И. Полянский, Жизнь животных (7 том)., в 7 т., Просвещение, 1989.
   
4. 
   Ю.А. Столповский, А.Н. Евсюков, Г.Е. Cулимова, Геномное разнообразие по маркерам межмикросателлитного полиморфизма у пород крупного рогатого скота // Генетика. 2013. Т. 49. №5. с.641-648.
   
5. 
   Ю.А. Столповский, Полиморфизм молекулярно-генетических маркеров у овец романовской породы // Известия ТСХА, выпуск 2. 2008 с. 131-136.
   
6. 
   М.В. Теликов, ”Кари Маллис, изобретатель ПЦР”, «Химия и жизнь», №8, 2006 г, стр.6.
   
7. 
   Cho YS, Hu L, Hou H, Lee H, Xu J, Kwon S, Oh S, Kim HM, Jho S, Kim S, Shin YA, Kim BC, Kim H, Kim CU, Luo SJ, Johnson WE, Koepfli KP, Schmidt-Küntzel A, Turner JA, Marker L, Harper C, Miller SM, Jacobs W, Bertola LD, Kim TH, Lee S, Zhou Q, Jung HJ, Xu X, Gadhvi P, Xu P, Xiong Y, Luo Y, Pan S, Gou C, Chu X, Zhang J, Liu S, He J, Chen Y, Yang L, Yang Y, He J, Liu S, Wang J, Kim CH, Kwak H, Kim JS, Hwang S, Ko J, Kim CB, Kim S, Bayarlkhagva D, Paek WK, Kim SJ, O'Brien SJ, Wang J, Bhak J. The tiger genome and comparative analysis with lion and snow leopard genomes. Nat Commun. 2013;4:2433.
   
8. 
   Christopher J. Connora, Hongliang Luoa, Brian B. McSpadden Gardenerb, Hua H. Wanga, Development of a real-time PCR-based system targeting the 16S rRNA gene sequence for rapid detection of Alicyclobacillus spp. in juice products, International journal of food microbiology., 2005., Volume 99, Issue 3, p. 229-235
   
9. 
   Echegaray J., Villa C., Noninvasive monitoring of wolves at the edge of their distribution and the cost of their concervation, Animal concervation, 2009, Issue 1367-9430, p. 1-5
   
10. 
    Henry P., Miquelle D., Sugimoto T., Mccullough D. R., Caccone A., Russello M. A., In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger, Molecular ecology, 2009, Volume 10, Issue 1, p. 1- 12
    
11. 
    Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R., Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions., Biotechnology., 1993, v.11, p. 1026-1030
    
12. 
    Higuchi R., Dollinger G., Walsh P. S., Griffith R., Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences., Biotechnology., 1992., v. 10., p.413-417
    
13. 
    Holly B. Ernest, Esther S. Rubin, Walter M. Boyce, Fecal DNA analysis and risk assessment of mountain lion predation of bighorn sheep, Journal of Wildlife Management, 2002, Volume 1, Issue 66, p. 75-85.
    
14. 
    Menotti-Raymond M, David V, Lyons L, Schaffer A, Tomlin J, Hutton M, O'Brien S, A Genetic Linkage Map of Microsatellitesin the Domestic Cat (Felis catus), Genomics, 1999, Volume 57, Issue 43, p. 9-23
    
15. 
    Michelle L. Green, Denise L. Herzing, John D. Baldwin, Noninvasive methodology for sampling and extraction of DNA from free-ranging Atlantic spotted dolphins (Stenella frontalis), Molecular ecology notes, 2007, Issue 7, p. 1287-1292
    
16. 
    Okello J.B., Wittemyer G., Rasmussen H.B., Douglas-Hamilton I., Nyakaana S., Arctander P., Siegismund H.R., Noninvasive genotyping and mendelian analysis of microsatellites in African savannah elephants, Journal of Heredity, 2005, Volume 6, Issue 96, p. 679-687
    
17. 
    Sugimoto T, Nagata J, Aramilev V, McCullough D, Population size estimation of Amur tigers in Russian Far East using noninvasive genetic samples, Journal of Mammalogy, 2012, Volume 93, Issue 1, p. 93-101
    

1. 
   [http://www.zoopicture.ru/stellerova-korova/]
   
2. 
   [http://crazy-zoologist.livejournal.com/146107.html]
   
3. 
   [http://www.bigcatfiles.info/tiger/]
   
4. 
   [http://www.bigcatfiles.info/tiger/yavanskij-tigr/]
   
5. 
   [http://www.wwf.ru/resources/news/article/2723]
   
6. 
   [http://www.wwf.ru/resources/news/article/1688]
   
7. 
   [http://www.wwf.ru/resources/news/article/1564]
   
8. 
   [http://www.wwf.ru/resources/news/article/12118],
   
9. 
   [http://www.wwf.ru/resources/news/article/12268],
   
10. 
    [http://www.wwf.ru/resources/news/article/9222]
    
11. 
    [http://www.wwf.ru/resources/news/article/9286]
    
12. 
    [http://www.wwf.ru/resources/news/article/9497]
    
13. 
    [http://www.nnzoo.ru/mammals/218-amurskiy-tigr-panthera-tigris-altaica.html]
    
14. 
    [https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BC%D1%83%D1%80%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%82%D0%B8%D0%B3%D1%80#mediaviewer/File:Amur_Tiger_Panthera_tigris_altaica_Cub_Walking_1500px.jpg]
    
15. 
    [http://news.vse42.ru/feed/show/id/2905365]
    
16. 
    [http://www.wwf.ru/resources/news/article/1845]
    
17. 
    [https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BC%D1%83%D1%80%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%82%D0%B8%D0%B3%D1%80#.D0.A0.D0.B0.D1.81.D0.BF.D1.80.D0.BE.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B5.D0.BD.D0.B8.D0.B5]
    
18. 
    [http://www.bastak.ru/tigers2.html]
    
19. 
    [http://www.ecosystema.ru/07referats/tiger/tiger.htm]
    
20. 
    [http://www.murkota.ru/semeistvo-koshach-ih/amurskii-tigr.-razmnozhenie.html]
    
21. 
    [https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BC%D1%83%D1%80%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%82%D0%B8%D0%B3%D1%80 - .D0.9E.D1.85.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B0
    
22. 
    [http://humbio.ru/humbio/moldiagn/000072bd.htm]
    
23. 
    [http://oftalmic.ru/diagn_rflp.php]
    
24. 
    [https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%BE%D1%80%D0%BE%D1%82%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%82%D0%B0%D0%BD%D0%B4%D0%B5%D0%BC%D0%BD%D1%8B%D0%B9_%D0%BF%D0%BE%D0%B2%D1%82%D0%BE%D1%80]]
    
25. 
    [http://molbiol.edu.ru/review/04_03.html]
    
26. 
    [http://sudexpa.ru/expertises/genetic/mt_dna/]
    
27. 
    [http://www.gazeta.ru/social/2008/09/17/kz_2839539.shtml]
    
28. 
    [http://molbiol.ru/protocol/#a12]
    
29. 
    [https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D0%BC%D0%B5%D1%80%D0%B0%D0%B7%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D1%86%D0%B5%D0%BF%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D1%80%D0%B5%D0%B0%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F#mediaviewer/File:Pcr.png]
    
30. 
    [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome?linkname=gene_genome&querykey=3]