CAT - хлорамфениколацетилтрансфераза

82
3.2.1 Жасушаға енгізілетін векторлар түрлері. 
Векторлардың бірнеше түрі болады: 
 Бактериалды плазмидалар. 
Бактериялардың жасушалық ДНҚ-сының басым бөлігі хромосомада 
болады (мысалы, E.coli-де 4 млн.жұп нуклеотид). Бірақ, хромосомадан басқа 
бактериалардың ішінде өте ұсақ, сақина тәрізді ДНҚ молекулалары 
(плазмидалар) болады, олардың ұзындығы небары бірнеше мың жұп 
нуклеотид (молекулалық массасы 1,5–нан 300 мегадальтонға дейін, 1МД =
1500 жұп негіз.) Мұндай мини-хромосомаларды плазмидалар деп атаймыз. 
Әдетте плазмидалардың құрамына антибиотиктерге тұрақтылықты 
кодтайтын гендер (R-плазмидалар) және кейбір органикалық қосылыстардың 
катаболизмін реттейтін гендер (D-плазмидалар немесе деградация 
плазмидалары) кіреді. Мұндай гендер плазмидаларда болғандықтан, олардың 
саны біршама көп болады. Плазмидалардың гендерді өте көп копиямен түзуі, 
ферменттерді 
көп 
мөлшерде 
синтездеп, 
антибиотиктерді 
немесе 
ксенобиотиктерді ыдырату қабілетіне ие етіп, оларға төзімділігіне ықпал 
етеді. Плазмидалар барлық жерде кездеседі, өйткені оларды бактериялардың 
барлық штаммдары мен түрлерінен бөліп алуға болады, бірақ плазмидалар 
геномның міндетті түрде болатын компоненті емес, ал кейбір 
бактериялардың табиғи штаммдарында плазмидалар тіптен жоқ.
Плазмидалық ДНҚ хромосомалық ДНҚ-дан бірнеше есе кем 
болғандықтан, оларды таза күйінде бөліп алу оңай. Бактериялардың 
құрамында мұндай плазмидалар ешқашан болмаса да, кальций иондары бар 
ортада реципиент бактериялар плазмидаларды оңай енгізіп ала алады, оған 
қоса, бактерия ұрпақтарының құрамында да осы енгізіліп алынған 
плазмидалардың көптеген копияларын кездестіруге болады. Алайда, 
бактериалдық жасуша құрамына плазмидалардың тек бір типі ғана болуы 
мүмкін. Бұл – плазмидалардың сәйкессіздігі құбылысы. 
Осыған байланысты, сәйкессіздік Inc топтары болады – олар Inc-
топтары деп аталады («Inc» сөзі ағылшын тілінен аударғанда – 
incompatibility, яғни «сәйкессіздік, сыйымсыздық» деген мағынаны 
білдіреді.) 
Жасушадағы плазмидалардың саны айтарлықтай өзгеріп тұрады. Бұл 
жағдай жасушаның және плазмиданың қасиеттеріне байланысты. 
«Енжар» регуляцияда болатын плазмидалардың саны 10-200-ге 
жеткенше көбейе береді, ал егер плазмида «қатаң» түрде регуляцияда болса, 
ол 
хромасомамен 
бірдей 
репликацияланып 
отырады. 
Мұндай 
плазмидалардың саны біреу немесе бірнешеу болады. Әлбетте, 
рекомбинантты ДНҚ-ларды көбейту үшін плазмидалардың бірінше түрін 
қолдануға тырысады. Бірақ, ол міндетті емес, өйткені хлорамфениколы бар 
ортада плазмидалар хромосомаға тәуелсіз көбейіп, олардың саны бірнеше есе 
өсе алады. 
Қолданылуы тұрғысынан клондау үшін қолданылатын плазмида pBR322 
табиғи плазмиданың негізінде E.coli-ден бөліп алынды. Бұл плазмиданың 

83
құрамында екі антибиотикке: ампициллин және тетрациклин төзімділік 
гендері және әр антибиотикке төзімділік гендерінде рестрикция сайты бар. 
Егер бөтен геннің фрагменті сол аймаққа енсе, ол аймақтың белсенділігі 
жоғалады. Яғни, фрагменттің сәтті енуін рецепиент бактерияның сол 
антибиотик бар ортада тіршілігін жойғанын оңай анықтауға болады. Бірақ, 
антибиотикке төзімділік сақталады. Осылайша, вектор тек рекомбинантты 
плазмида енген бактерия клондарын детекциялауға мүмкіндік береді.
 Вирустар 
Жасушаның өлуіне әкелмей, қожайын жасушаның геномына енетін 
вирустар бар. Олар қожайынмен бірге көбейіп, немесе оның бақылаусыз 
(өздігінен) көбееюіне әкледі, демек оны ісік жасушасына айналдырады. 
Ондайларға SV-40 және полиома вирусы жатқызылады. Кейбір ісік 
тударатын РНҚ-вирустары енгізген кезде, олар вирустық бөлшектердің 
жасушаның лизисін шақырмай, одан бөлініп кетуін шақырады. Ондай 
вирустарға, мысалы, ретровирустарды (Раустың саркома вирусы мен АҚТҚ 
вирусын) келтірсе болады. Бактериалды жасушаларға вектор ретінде 
көбінесе бактериофагтар қолданылады. 
Вирустар бөтен ДНҚ-ны енгізуге арналған векторлардың негізгі 
талапкерлері саналады. Вирустық инфекция кезінде әр жасуша бөтен геннің 
көптеген копиясына ие бола алады. Бөтен ДНҚ молекуласын мықты 
вирустық промоторлардың бақылауында болатындай етіп енгізуге болады. 
Сонда ген экспрессиясының жоғары дәрежесін, яғни олардың өнімдерін 
зерттеуге жағдай жеңілдейді.
Соңғы кезде, көптеген ерекше векторлар және олардың жануарлар мен 
бактериаларда репликациялана алатын, клондалып жатқан геннің 
жануарларда экспрессиясын эффективті түрде өткізе алатын рекомбинантты 
туындылары жасалды. Ең көп қолданылатын векторлардың құрамында 
pBR322 плазмида мен SV40 ДНҚ-сы транскрипциясының интактті бастапқы 
аймағынан тұрады. Ал қажетті ген соңғы гендер промоторларының 
бақылауына немесе қосымша бастапқы промотордың бақылауына түседі. 
Мысалға, SV40 ДНҚ-сына рекомбинантты вирус жұқтырылған маймыл 
жасушаларының линиясында экспрессияланатын көжектің β-глобинінің гені 
енгізілді (жасушаларда глобин генінің м РНҚ-сы да, ақуыздың өзі де 
синтезделеді).
Вирус оған ДНҚ рекомбинацияланғаннан кейін өміршеңдігін 
жоғалтпауы керек. Ең оңайы вирустарды бактерияларға енгізу болып 
табылады. Вирустарды вектор ретінде қолданудың бір кемшілігі – олардың 
мөлшерінің кішкентай болуы. Оған қоса, вирустар азғантай қожайындарды 
ғана инфециялай алады.
Одан басқа, фаг ДНҚ-сы мен плазмидадан тұратын гибридті векторлар 
да болады. Оларға космидалар мен фазмидалар жатады.

жүктеу/скачать 1.81 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: