Деформационное и ориентационное структурообразованиЕ фибриллярных белков при неньютоновском течении и электродиализЕ ионов 01. 04. 19 Физика полимеров
Неньютоновское течение растворов в продольном поле
жүктеу/скачать 395.9 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Гистерезисные эффекты при течении смеси растворов фиброина и кератина.
- В четвертой главе
- Электродиализ ионов при сдвиговом течении растворов белков.
- Электродиализ ионов при продольном течении растворов белков.
- I этап
- II этап .
Неньютоновское течение растворов в продольном поле. Продольное течение генерировали с помощью капиллярного вискозиметра Кувшинского на установке «Реодинамооптиметрии» Франка-Келлера для 10 %-ных растворов фиброина и кератина. При различных значениях градиента скорости (g) измеряли значения эффективной вязкости (эфф), характеризующей объемные взаимодействия макромолекул при ориентационном упорядочении их в потоке, а также величины фактора ориентации () цепей в продольном поле: g ≈ Q/Sкlк, где Q - секундный расход раствора, прошедшего через поперечное сечение (Sк) капилляра ВК длиной lк; эфф kPt, где k 10,102 – константа ВК, P – перепад давления при течении растворов под вакуумом; t – время заполнения калибровочного объема V; (n/n )0,5. Полученные результаты показали, что значение эфф для фиброина и кератина в начале незначительно снижается (рис.3.а). Это свидетельствует о начале ориентации цепей. Однако с ростом g значение эфф увеличивается, что показывает повышение взаимодействий между ориентированными молекулами фиброина (при g > 150 c-1), а также кератина (при g >500 c-1). Дальнейшее повышение g сопровождается выходом кривых на плато при 0,8, что свидетельствует о достижении полного ориентированного состояния белков в продольном поле. Несмотря на то, что белковые молекулы находятся достаточно близко друг к другу для завершения ориентационной кристаллизации, этого не происходит из-за экранирования ионами карбоксильных и амидных групп цепей, что препятствует образованию межмолекулярных водородных связей. Тем не менее, незначительная ассоциация цепей имеет место, система в гелеподобном виде сохраняет свою оптическую анизотропию более чем 12 – 15 часов после выключения продольного поля. 
Наличие гистерезиса при неньютоновском течении растворов, генерированном в продольном поле, оценивали по изменению ( ) цепей при различных (g). Полученные результаты для 10 % -ных растворов фиброина в 2,5 М LiCl-ДМФА и кератина в 2,5 М NaOH-вода приведены на рис. 3.б. Повышение температуры способствовало сужению формы гистерезисной петли и смещению их в область больших значений g. Образование гистерезиса, при этом обусловлено нахождением цепей в различных конформационных состояниях. А именно, при повышении g выполняется работа по разворачиванию и ориентации молекулярных цепей под действием внешних гидродинамических сил, а при снижении g, т.е. при понижении внешнего воздействия для ориентированных цепей необходимо дополнительное усилие для сворачивания, т.е. релаксации. Для выполнения такой работы расходуется тепловая энергия. В этом случае молекулы белков стремятся приобрести термодинамически выгодную конформацию, т.е. переходят в частично спирализованное состояние. Этот процесс требует некоторого времени для преодоления межмолекулярных трений в концентрированном растворе, исходя из собственных энергетических возможностей, заложенных в белковых молекулах. Следовательно, можно считать, что смещение гистерезиса в область больших g, обусловлено, гидродинамическими факторами, а сужение гистерезиса - термодинамическими факторами, связанными с активностью растворителя. Гистерезисные эффекты при течении смеси растворов фиброина и кератина. Смеси фиброина и кератина (соотношение 10:1) получали смешиванием их растворов, приготовленных в 2,5 М LiCl-ДМФА. Для этого кератин был переосажден из водно-щелочного раствора и растворен в 2,5 М LiCl-ДМФА. Следует отметить, что волокнистый кератин не растворяется в данном растворителе из-за наличия межмолекулярных S - S связей. Исследовали неньютоновское течение данной смеси при сдвиговом и продольном полях при 25 оС. Из сравнения данных, приведенных на рис.4, видно, что при сдвиговом поле значение эффективной вязкости (lnэфф) постепенно падает с ростом градиента скорости и имеется излом в интервале g ≈ 60 90 c-1. При обратном измерении излом незначителен и наблюдается гистерезис. Образование гистерезиса в данном случае обусловлено различием деформационной перестройки макромолекул при прямом и обратном измерении вязкости в зависимости от градиента скорости. В случае продольного поля вначале наблюдается снижение эфф с ростом до g ≈ 65 с-1, далее наблюдается рост эфф до g ≈130 с-1. Повышение эфф в данном случае обусловлено, по-видимому, усилением взаимодействий цепей из-за их ориентированной укладки в сходящем потоке. Измерение вязкости при обратном направлении, т.е. при снижении градиента скорости, имеет практически аналогичный вид. Однако, она значительно смещена в область малых градиентов скорости и при этом наблюдается гистерезис. В случае смеси гистерезисная петля относительно большая, что обусловлено достижением сравнительно высокой степени взаимодействий между молекулами фиброина и кератина, поскольку, отдельные растворы данных белков не характеризуются таким выраженным гистерезисом.
а б
Рис.4. Гистерезисные эффекты при сдвиговом (а) и продольном (б) течении растворов фиброина (ФБ) и кератина (КР), а также их смеси ФБ:КР (10:1) В четвертой главе излагаются результаты исследования влияния электродиализа ионов на структурообразование фиброина и кератина в неньютоновском потоке. Эффективность электродиализа оценивали сравнением его с обычным диализом, проводя опыты с умеренно-концентрированным раствором фиброина в 2,5 М LiCl-ДМФА, используя в качестве диализата ДМФА. Соотношение раствор/диализат составляло 1:1000. Выявлено, что в обычном диализе ассоциаты белков наблюдаются через tасс 150 мин с начала опыта, тогда как при электродиализе под действием I 10 мА требуется всего tасс 30-60 с. При этом вначале наблюдался переход «раствор-гель» с ассоциированием цепей; далее происходило помутнение с появлением коллоидоподобных частиц. Для этого необходимо было уменьшение LiCl от 2,5 М до 1,0 М. Однако молекулы фиброина оставались в неупорядоченном состоянии и имели фактора ориентации n/n 0,012. По закону Фарадея m kIt , определяли значение электрохимического эквивалента k 0,044*10-6 кг/кл для раствора фиброина в 2,5 М LiCl-ДМФА и k 0,21*10-6 кг/кл для растворителя 2,5 М LiCl-ДМФА. Видно, что значение k более чем на один порядок меньше для раствора фиброина. Это свидетельствует о заметном взаимодействии фиброина с ионами соли. Электродиализ ионов при сдвиговом течении растворов белков. Для проведения исследований разработана установка, позволяющая проводить электродиализ ионов при сдвиговом течении растворов белков (рис.5). Направление перемещения ионов через мембраны к электродам, находящимся в диализате совпадает с направлением деформации белковых молекул за счет центробежной силы Fцб = V2r (где V - объем и - плотность раствора, - угловая скорость вращения, r - расстояние от оси вращения). 
Рис.5. Схема проведения электродиализа ионов при сдвиговом течении растворов белков: 1,1” – электроды; 2 – диализат; 3 – мембрана; 4 – раствор белков; 5 – враща-ющий цилиндр; 6 – поляризационный луч; 7 – перемещение ионов; М – электромотор; РМ – поляризационный микроскоп
Текучесть (r) раствора белков определяли по формуле Маргулеса, контролируя изменение скорости вращения цилиндра при подаче на электромотор (М) определенного электрического напряжения: r 1r 2hR3/bМв где r – вязкость раствора; h- высота цилиндра; R– параметр гидродинамической ячейки; b- расстояние между цилиндрами; Мв = rFцб - момент вращения. Соотношение r/rо 0 (где rо исходное значение текучести) характеризует потери самостоятельного течения растворов при ассоциации цепей в сдвиговом поле. Полученные результаты для растворов белков (С[] 5) приведены на рис.6. Видно, что кривые имеют S-образный вид, характерный для неньютоновского течения. Установлено, что при обычном диализе растворы (V 50 cм3) теряют текучесть в течение 180 – 200 мин (кривые 1, 2). При электродиализе (I 5 мА) растворов, находящихся под действием постоянного сдвигового напряжения (100 н/м2) обнаруживается увеличение текучести в течение 30 - 60 с. Затем наблюдается интенсивное уменьшение текучести в интервале 100 -150 с и потеря текучести при времени электродиализа >180 c (кривые 1’, 2’). Таким обpазом, полученные графики показывают эффективность электродиализа ионов для деформационного структурообразования белков при сдвиге. Из данных рис.7, видно, что повышение значения гораздо раньше начинается при электродиализе ионов (кривые 1’, 2’) по сравнению с обычным диализом (кривые 1, 2). Это объясняется тем, что при электродиализе ионов создаются более благоприятные условия для увеличения межмолекулярных контактов и зацепления деформационно-упорядоченных белков при сдвиге. Поскольку, ассоциирование белков при электродиализе ионов начинается в течение 120 с, то достигнутое за такое время значение 0.4 свидетельствует об упорядочении цепей. Дальнейшее воздействие сдвигового поля заметно увеличивало деформационное упорядочение белков ( 0,6). При этом происходило фазовое разделение в растворе, т.е. у плоскости стенки мембраны образовывалась сжатая гелеобразная фаза, которая сохраняла свою структуру после прекращения воздействия сдвигового поля. 
Рис.6. Зависимость относительной текучести (r/rо) растворов фиброина в 2,5 М LiCl-ДМФА (1, 1’) и кератина в 2,5 М NaOH-вода (2, 2’) от времени диализа (1, 2) и электродиализа (1’, 2’) при сдвиговом течении Рис.7. Зависимость фактора ориентации макромолекул () от времени диализа (1, 2) и электродиализа (1’, 2’) ионов при сдвиговом течении растворов фиброина в 2,5 М LiCl-ДМФА (1, 1’) и кератина в 2,5 М NaOH-вода (2, 2’)   
Содержание ионов (m) в полученных образцах определяли по изменению их массы после экстракции на аппарате Сокслет в течение 8 часов. Выявлено, что с увеличением времени электродиализа содержание ионов в гелеобразных образцах уменьшается, причем, за 5 мин остается около 1/10 части ионов в гелеобразной фазе. Дальнейший электродиализ ионов замедляется и за 275 мин в образцах остается 1/20 часть ионов. Замедление выхода ионов обусловлено с одной стороны уменьшением содержания свободных ионов, а с другой стороны, наличием взаимодействия «белок-ион» в образцах. Отрыв ионов из этого образования требует дополнительного усилия и времени. Таким образом, получен гелеобразный осажденный образец, способный сохранять свою форму. Установлено влияние электродиализа ионов на ассоциирование фибриллярных белков, находящихся в различных конформационных состояниях. Показаны возможности регулирования процесса структурообразования белков в потоке под влиянием электродиализа.
цепи (фиксированные); 4’- ПВХ трубки (диаметром 0,5 см)
2, 2’- электроды (угольные); 3, 3' – мембраны (целлофановые); 4 - капиллярный вискозиметр ВК; 5 - линии сходящего потока; 6 - направление движения ионов; Р – фиброина в 2,5 М LiCl- ДМФА; Д, Д’- диализат (вода); И - изотропные, О – ориентированные и А - ориентированно-ассоциированные цепи; Р - перепад давления. I этап 
Рис.8. Схема проведения электродиализа ионов (I этап) и фильтрации ориентационно-ассоциированных белков (II этап) при продольном течении растворов I этап. Повышение силы электрического тока ускоряет процесс электродиализа ионов, и в продольном поле происходит интенсивное снижение текучести растворов фиброина, кератина и их смеси, которое свидетельствует об ассоциировании ориентационных молекул белков в потоке (рис. 9). При этом ассоциирование молекул фиброина в присутствии кератина незначительно ускоряется, поскольку текучесть смеси начинает снижаться раньше, чем у исходного раствора и взаимодействие упорядоченных цепей в смеси завершается, не достигая величины фактора ориентации, обнаруженного при этих условиях для фиброина. В принципе, при упорядоченном структурообразовании фибриллярных белков возможна реализация конфигурационной информации, заложенной в их цепях. Такая особенность белков реализуется при ориентационной кристаллизации в процессе волокнообразования. 
Рис.9. Изменение относительной текучести (tк/ti) растворов и фактора ориентации (β) фиброина (ФБ) и кератина (КР) в продольном поле при электродиализе ионов
II этап. Растворы, прошедшие через капилляр ВК, перемещались по поливинилхлоридной трубке к фильтру Шотта и подвергались фильтрации. При этом контролировалось изменение параметров, приведенных в таблице 1. Таблица 1 Влияние электрического поля на удаление ионов при продольном течении 10 %-ных растворов фиброина в 1,5 М LiCl-ДМФА и его смеси с кератином (10:1)
Видно, что по мере увеличения силы электрического тока объемный расход растворов незначительно снижается и увеличивается фактор ориентации цепей (до 0,8), а также наблюдается удаление ионов в диализат и на электроды. На фильтре концентрируются ориентационно-ассоциированные молекулы белков в сильно сжатой гелеобразной форме, в которой остается незначительное количество ионов. Такие осажденные массы получали для смеси фиброина с кератином, которые содержали заметно большее количество ионов и характеризовались сравнительно меньшим значением фактора ориентации цепей ( 0,7). Продолжение фильтрации приводит к удалению растворителя и образованию осажденной массы белков с небольшим количеством остаточных ионов. Однако, из-за высокой гигроскопичности ионов лития не удается достигнуть полного удаления влаги. Также ионы Li+ не полностью связываются с молекулами белков и имеют некоторую степень свободы для движения.
жүктеу/скачать 395.9 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
