Действие малых доз инкорпорированного плутония-239 на частоту анеуплоидии в соматических клетках человека 03. 02. 07 генетика

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Таблица 1

Характеристика групп индивидов, обследованных
с помощью интерфазного FISH-анализа

Параметр	Контрольная группа	Группа работников СХК
FISH c центромеро-специфичными ДНК-зондами на хромосомы 2, 7, 8, 12, X, Y
Число индивидов	33	27
Средний возраст ± ст. ошибка (годы) (диапазон)	54 ± 2 (32-70)	58 ± 2 (38-71)
Средняя активность инкорпорированного Pu-239 ± ст. ошибка (нКи), (диапазон)	-	34,78 ± 8,57 (10-188)
Число проанализированных клеток	99000	81000
FISH c панцентромерными ДНК-зондами
Число индивидов	20	20
Средний возраст ± ст. ошибка (годы) (диапазон)	53 ± 2 (36-70)	59 ± 2 (39-70)
Средняя активность инкорпорированного Pu-239 ± ст. ошибка (нКи), (диапазон)	–	35,14 ± 9,49 (10-183)
Число проанализированных клеток	40000	40000

Для достижения поставленной цели был применен метод FISH c центромеро-специфичными ДНК-зондами. Использование ДНК-зондов на прицентромерные области отдельных хромосом набора позволяет дифференцировать хромосомное нерасхождение и отставание, возникающие вследствие повреждения различных клеточных мишеней (Iarmarcovai et al., 2006). Выбор хромосом был продиктован возможностью исследования межхромосомной вариабельности аномалий сегрегации по хромосомам набора, отличающимся по размеру. Учитывая многократно отмечавшееся в литературе более частое отставание половых хромосом по сравнению с аутосомами (Guttenbach et al., 1994; Falck et al., 2002), в анализ были включены хромосомы X и Y. Известно, что анеуплоидия по хромосомам 7, 8 и 12 часто отмечается при различных формах лейкозов, что также обусловливает выбор для анализа именно этих хромосом (Закурдаева и др., 2009; Porpaczy et al., 2009; Xu et al., 2009).

Кроме того, в настоящем исследовании был использован метод FISH c панцентромерными ДНК-зондами (рис. 1), позволяющий оценить сравнительный вклад анеугенного и кластогенного эффекта, благодаря анализу частоты микроядер с наличием флуоресцентных сигналов (микроядра, содержащие отставшие хроматиды с центромерной последовательностью) и их отсутствием (микроядра с хромосомными фрагментами). Использование панцентромерных ДНК-зондов дает возможность получить интегральную оценку хромосомного отставания одновременно по всем гомологам в кариотипе человека. Наконец, проведение анализа на цитокинез-блокированных двухъядерных лимфоцитах позволяет существенно повысить информативность оценки анеугенных эффектов вследствие использования второго ядра в качестве контрольного при определении событий хромосомного нерасхождения и отставания (Fenech, 2010).

Рис. 1. Комбинация оценки микроядер и FISH на цитокинез-блокированных двухъядерных клетках (Fenech, 2007): а – потеря ацентрического фрагмента; б – отставание целой хромосомы; в – нерасхождение хромосом в ядрах двухъядерной клетки.

Статистическую оценку межгрупповых различий по частоте анеуплоидии и микроядер производили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Для оценки сравнительного участия механизмов хромосомного нерасхождения и отставания в возникновении анеуплоидии в группе индивидов с инкорпорированным плутонием по сравнению с контрольной группой был использован точный критерий Фишера. Для установления межхромосомной вариабельности частоты аномалий сегрегации в нормальных условиях и при мутагенной нагрузке применялся критерий χ². Влияние инкорпорированного плутония на отдельные механизмы возникновения анеуплоидии оценивалось с помощью отношения шансов. Ранговый критерий Спирмана использовался для анализа корреляции частоты аномалий с активностью инкорпорированного плутония и возрастом обследованных индивидов. Все статистические процедуры были выполнены с использованием программного обеспечения
STATISTICA 6.0 (StatSoft).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Таблица 2

Частота ядер с анеуплоидией по хромосоме X практически не отличалась в группе работников СХК и контрольной группе, будучи при этом значительно выше в контрольной группе по сравнению с частотой анеуплоидии по аутосомам (табл. 2). Повышенная по сравнению с аутосомами частота анеуплоидии по половым хромосомам в контрольной группе и отсутствие повышения частоты при воздействии ионизирующего излучения может указывать на существование различных механизмов, приводящих к возникновению анеуплоидии по аутосомам и половым хромосомам. С другой стороны, клетки с анеуплоидией по аутосомам и по половым хромосомам могут обладать различной жизнеспособностью, что обусловливает наблюдаемые различия.

Таблица 3

В нашей работе последствия хромосомного нерасхождения являлись преобладающими, составляя для аутосом в среднем от 81 до 97 % от частоты всех числовых хромосомных аномалий в группе работников плутониевого производства и от 91 до 94 % в контрольной группе. Для хромосомы Y доля событий нерасхождения достигала 82 % от всех хромосомных аномалий в группе работников и 68 % в контрольной группе, а для хромосомы X – 75 % и 64 %, соответственно (табл. 4). При анализе с помощью точного критерия Фишера для каждой из исследованных хромосом в отдельности не было обнаружено различий между группой работников СХК и контрольной группой по доле участия механизмов нерасхождения и отставания в возникновении анеуплоидии. Однако при суммировании числа событий хромосомного нерасхождения и отставания для всех исследованных хромосом было выявлено статистически значимое превышение числа событий хромосомного нерасхождения в группе индивидов с инкорпорированным плутонием (OR=1,56, χ²=3,84, p=0,034), что указывает на преимущественное действие инкорпорированного плутония в большей степени на механизмы, ответственные за хромосомное нерасхождение.

Таблица 4

Доля хромосомного нерасхождения и отставания

При сравнении частот анеуплоидии между аутосомами 2, 7, 8 и 12 не было выявлено статистически значимых различий. Несмотря на однокопийность половых хромосом у индивидов мужского пола, отмечалась значимо большая частота аномалий сегрегации половых хромосом по сравнению с аутосомами. Так, частота отставания по хромосоме Y в контрольной группе значимо отличалась в сравнении со всеми аутосомами и хромосомой X (p<0,01). Однако в группе работников для частоты отставания по хромосоме Y в сравнении с другими хромосомами значимых отличий не наблюдалось. Также не было обнаружено значимых отличий по частоте нерасхождения хромосомы Y по сравнению с другими хромосомами как в группе индивидов с инкорпорированным плутонием, так и в контрольной группе. Частота нерасхождения по хромосоме Х была значимо выше, чем соответствующие значения для аутосом и хромосомы Y в контрольной группе. Значимые отличия по отставанию хромосомы Х в сравнении со всеми аутосомами и хромосомой Y отмечались и в контрольной группе, и в группе работников.

Принимая во внимание однокопийность хромосом X и Y у исследуемых индивидов мужского пола, математическая вероятность числовых аномалий с участием аутосом должна быть в два раза выше, чем для половых хромосом при предположении о равенстве вероятностей возникновения нарушений сегрегации по каждому отдельному гомологу в хромосомном наборе. Поэтому для сравнения вероятности возникновения числовых аномалий по аутосомам и половым хромосомам необходимо произвести расчет числа аномалий на один гомолог. Для этого требуется частоту аномалий по аутосомам разделить на 2. При проведении такого анализа частота хромосомного нерасхождения по половым хромосомам в обеих группах значимо превысила соответствующие значения из расчета на один гомолог взятых в анализ аутосом (p<0,001).

Кроме того, с помощью критерия χ² была проведена оценка отклонения наблюдаемой частоты аномалий сегрегации по половым хромосомам от ожидаемой при условии равновероятного возникновения числовых хромосомных нарушений по каждой из хромосом набора. В результате было обнаружено, что и в группе индивидов с инкорпорированным плутонием (χ² = 139,37, df=6, p<0,000001), и в контрольной группе (χ² = 714,58, df=6, p<0,000001) частота аномалий сегрегации по половым хромосомам значимо отличалась от теоретической частоты возникновения ошибок сегрегации по всем хромосомам набора.

Сравнительный анализ межхромосомной вариабельности частоты анеуплоидии по разным хромосомам набора показал, что размер хромосомы при этом не является определяющим фактором. Это подтверждается тем, что в нашем исследовании частота анеуплоидии по хромосоме X значимо превышает частоту числовых нарушений по хромосомам 7, 8 и 12, сходных с ней по размеру. Кроме того, не было обнаружено значимых отличий по частоте анеуплоидии между исследованными аутосомами группы С (7, 8, 12) и хромосомой 2, что также указывает на незначительное влияние размера хромосомы на частоту числовых нарушений. Большая частота отставания половых хромосом по сравнению с аутосомами может быть объяснена более дистальным положением половых хромосом при движении к полюсам в процессе митотического деления (Catalan et al., 2000; Falck et al., 2002). Однако более высокая частота хромосомного нерасхождения по половым хромосомам по сравнению с аутосомами остается в этом случае необъясненной. Вероятно, межхромосомная вариабельность по частоте аномалий сегрегации в клетке подвергается влиянию нескольких важных факторов, среди которых конфигурация хромосомы и ее ориентация в пространстве клетки занимают особые места.

Оценка влияния инкорпорированного плутония на частоту потери целых хромосом и их фрагментов. Малые значения частоты отставания по каждой отдельной паре гомологов при использовании FISH c центромеро-специфичными ДНК-зондами на отдельные хромосомы набора не позволяют провести статистически достоверный анализ хромосомного отставания. В связи с этим, результаты FISH-анализа с использованием панцентромерных ДНК-зондов, позволяющих получить интегральную оценку уровня хромосомного отставания, представляют очевидный интерес.

В группе работников СХК частота всех микроядер в двухъядерных лимфоцитах периферической крови составила 8,6 ‰ по сравнению с 5,1 ‰ в контрольной группе (табл.  5). Отличия между группами были статистически значимыми (p<0,001). При этом отмечалась значимо более высокая (p<0,001) частота центромеро-негативных микроядер в группе индивидов с инкорпорированным плутонием (4,7 ‰) по сравнению с контрольной группой (2,4 ‰) (табл.  5). Частота центромеро-позитивных микроядер с одним или несколькими флуоресцентными сигналами в группе работников СХК составила 3,9 ‰, что также значимо превысило соответствующую частоту в контрольной группе (2,7 ‰). Таким образом, действие инкорпорированного плутония-239 вызывает повышение частот центромеро-негативных и центромеро-позитивных микроядер в группе работников СХК по сравнению с контрольной группой в 1,96 и 1,44 раза соответственно. Однако, статистически значимых отличий по вкладу кластогенного (центромеро-негативные микроядра) и анеугенного эффекта (центромеро-позитивные микроядра) в суммарное влияние инкорпорированного плутония-239 на частоту микроядер не отмечалось (OR=1,35, p=0,63). В единичных случаях фиксировались анафазные мосты, частота которых в группе работников СХК составляла 0,3 ‰, а в контрольной группе – 0,1 ‰.

Частота микроядер в группе работников СХК и контрольной группе по данным FISH с панцентромерными ДНК-зондами.

Центромеро-позитивные микроядра могут образовываться как в результате отставания одной или нескольких хроматид/хромосом, так и в результате мультиполярного деления, вызванного, например, амплификацией центросом. В последнем случае микроядра содержат большое количество центромерных сигналов, соответствующих значительному количеству хромосом, не включенных ни в одно из дочерних ядер (Iarmarcovai et al., 2006; Silkworth et al., 2009). Преобладание среди центромеро-позитивных микроядер как в группе работников СХК, так и в контрольной группе микроядер с одним центромерным флуоресцентным сигналом (табл.  5) указывает на то, что преимущественным механизмом образования центромеро-позитивных микроядер является отставание отдельных хроматид.

Хотя значимо более высокая частота в группе работников СХК по сравнению с контролем была зарегистрирована только для микроядер с одним центромерным сигналом, процентное соотношение для всех классов центромеро-позитивных микроядер (1, 2 и >3 сигналов) оказалось равным в обеих группах, что указывает на то, что инкорпорированный плутоний, действуя одновременно на различные клеточные мишени, вызывает нарушения сразу нескольких механизмов потери хромосом. Это легко объяснить, если предположить, что действие инкорпорированного плутония в первую очередь определяется повышением окислительного стресса в результате вторичной ионизации молекул воды и биологических молекул. В то же время, активные формы кислорода вносят значительный вклад и в частоту спонтанно возникающих нарушений сегрегации хромосом за счет блокирования работы контрольной точки веретена деления, давая возможность клеткам с неприкрепленными или неправильно прикрепленными хромосомами беспрепятственно входить в анафазу (D'Angiolella et al., 2007). Пропорциональное влияние инкорпорированного плутония на все механизмы генерации хромосомного отставания может определяться его действием на их общую причину – уровень окислительного стресса в клетках.

Таким образом, в настоящем исследовании был обнаружен как кластогенный, так и анеугенный эффект инкорпорированного плутония, что выражалось в более высокой частоте центромеро-негативных и центромеро-позитивных микроядер в лимфоцитах периферической крови работников ядерно-химического по сравнению с индивидами контрольной группы.

В литературе неоднократно отмечалось возрастание числовых аномалий хромосом c увеличением возраста индивидов. Однако в настоящем исследовании при изучении влияния возраста на исследованные параметры не наблюдалось значимой корреляции частоты центромеро-негативных и центромеро-позитивных микроядер c возрастом как индивидов с наличием в организме инкорпорированного плутония-239 (R = – 0,06, p = 0,8 и R = 0,09, p = 0,7), так и лиц контрольной группы (R = 0,31, p = 0,15 и R = – 0,14, p = 0,53, соответственно). Также не было обнаружено зависимости частоты хромосомного нерасхождения и отставания от возраста индивидов в контрольной группе (R = – 0,18, p = 0,31 и R = 0,16, p = 0,39) и группе работников СХК (R = 0,15, p = 0,49 и R = 0,002, p = 0,99, соответственно). Основные литературные данные, касающиеся зависимости частоты числовых хромосомных нарушений от возраста индивидов, были получены для лиц женского пола, и в частности относились к частоте анеуплоидии по хромосоме X. Поэтому логично предположить, что для индивидов мужского пола, обследованных в настоящей работе, зависимость анеуплоидии от возраста может быть выражена не столь явно по сравнению с женщинами, что и обусловливает отсутствие выраженной корреляции.

В группе работников ядерно-химического производства 14 индивидов (52 %) попали в подгруппу с высоким уровнем микроядер, что может указывать на повышенный риск возникновения онкологической патологии. Для работников и добровольцев из контрольной группы с высоким уровнем микроядер было рекомендовано проведение диагностического осмотра и профилактических мероприятий по предотвращению возникновения онкозаболеваний. В целом, учитывая значимость анеуплоидии как фактора опухолеобразования (Duesberg et al., 2004), использование дифференциального анализа частоты центромеро-позитивных и центромеро-негативных микроядер для оценки риска возникновения рака в перспективе представляет собой удобный биомаркер для процедур генетического мониторинга.

Необходимость детального изучения влияния ионизирующего излучения на нормальную сегрегацию хромосом в соматических клетках человека обусловила проведение анализа анеугенного и кластогенного воздействия инкорпорированного плутония-239 в лимфоцитах периферической крови работников ядерно-химического производства. Использование в настоящем исследовании FISH c центромеро-специфичными ДНК-зондами на хромосомы набора позволило впервые обнаружить значимое влияние инкорпорированного плутония-239 на частоту хромосомного нерасхождения в лимфоцитах периферической крови работников ядерно-химического производства по сравнению с индивидами контрольной группы. Кроме того, был проведен сравнительный анализ вклада двух механизмов возникновения анеуплоидии – хромосомного нерасхождения и отставания – в общую частоту радиационно-индуцированных нарушений сегрегации хромосом. Было обнаружено, что хромосомное нерасхождение является преимущественной аномалией сегрегации хромосом при воздействии инкорпорированного плутония-239 (OR=1,56, χ²=3,84, p=0,034). Наблюдаемое действие инкорпорированного плутония-239, в первую очередь, на частоту хромосомного нерасхождения соответствует результатам, полученным для других типов ионизирующего излучения с высокой линейной передачей энергии – γ-излучения (Touil et al., 2000) и протонов (Sgura et al., 2001). Таким образом, впервые в мире нами было обнаружено значимое воздействие инкорпорированного плутония-239 на частоту хромосомного нерасхождения.

С целью анализа действия инкорпорированного плутония-239 на процессы, связанные с хромосомным отставанием, в настоящей работе была проведена оценка частоты центромеро-позитивных и центромеро-негативных микроядер с помощью FISH с панцентромерными ДНК-зондами. Более высокая частота центромеро-позитивных микроядер в двухъядерных лимфоцитах периферической крови работников СХК по сравнению с индивидами контрольной группы вместе с установленным с помощью FISH с ДНК-зондами на отдельные хромосомы воздействием на частоту хромосомного нерасхождения позволяют говорить о наличии анеугенного эффекта инкорпорированного плутония-239. Кроме того, наблюдался также статистически значимый кластогенный эффект, выражающийся в более высокой частоте центромеро-негативных микроядер в двухъядерных лимфоцитах периферической крови работников СХК по сравнению с индивидами контрольной группы. Проведенный анализ показал, что инкорпорированный плутоний-239 пропорционально воздействует на все механизмы, приводящие к хромосомному отставанию, хотя значимые различия между анализируемыми группами были обнаружены только для отставания отдельных хроматид, приводящего к образованию центромеро-позитивных микроядер с одним флуоресцентным сигналом. Таким образом, в настоящем исследовании впервые обнаружен анеугенный эффект хронического воздействия инкорпорированного плутония-239 в малых дозах, выражающийся в повышении частоты как хромосомного нерасхождения, так и хромосомного отставания. Кроме того, были выявлены преимущественные механизмы возникновения числовых хромосомных нарушений при воздействии инкорпорированного плутония-239.

Проведенное исследование позволяет с уверенностью говорить о наличии анеугенного компонента в воздействии инкорпорированного плутония-239 на соматические клетки работников ядерно-химического производства. Принимая во внимание более тяжелые последствия анеуплоидии для клетки по сравнению со структурными хромосомными аберрациями за счет нарушения работы большего числа генов и возможности развития геномной нестабильности, результаты данной работы позволяют более детально и предметно взглянуть на наиболее значимые процессы, лежащие в основе радиационно-индуцированного канцерогенеза. Учитывая первичную роль белкового аппарата в обеспечении правильного протекания процесса сегрегации хромосом, основным процессом, приводящим к возникновению числовых хромосомных нарушений в соматических клетках после воздействия радиации, должно быть повреждение белковых молекул в результате прямого и непрямого действия ионизирующего излучения. Помимо этого, по-видимому, анеуплоидия может также возникать в результате неправильного расхождения хромосом со структурными аномалиями в процессе деления клетки. Так, в настоящей работе предложена гипотеза, связывающая возникновение аномалий сегрегации хромосом с различными вариантами прохождения дицентрических хромосом через митотическое деление.