Омела белая Viscum album Mistletoe
жүктеу/скачать 2.26 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 2.2. Культура Клеток
- 2.3. Рост Клеток Анализа
- 2.4. Морфологические Колхицина Опухоли Анализа
2. Материалы и методы2.1. Омелы и фармацевтической промышленностиПроизводить компоненты для исследуемого омелы, омела растений (Viscum album Л. ssp. альбом), растущих по обе яблони (Malus domestica Borkh.) или сосны (Pinus sylvestris Л.), были собраны незадолго до Иванова дня и до конца года, соответственно. Один - два года,-старые листья, стебли, генеративные органы, и в зимний урожай созревшие ягоды были механически открыл в прокатный завод и добывается путем ферментации с омелой производных lactobacillus в дистиллированной воде. После трех дней брожения, экстракт получают прессованием и стерильной фильтрации. Основные зимние и летние омелы обладают препарат-экстракт соотношении 1  : 5 (экстракт 200 мг омелы свежего растения по 1 мл жидкости).
Производить anthroposophically обрабатываются Viscum album экстракт (APVAE), зима экстракт омелы подается в центре 1 Этот специфический процесс смешивания для зимнего и летнего экстракт омелы был разработан в Hiscia институт общества по исследованию рака (Арлесхайм, Швейцария), с акцентом на реализацию Штайнера оригинальные предложения, как можно более точно [11, 20]. Этот процесс используется для производства Iscador. В качестве образца сравнения относительно APVAE, мы использовали Viscum album экстракт (ВАЭ) состоящие из одних составляющих, как APVAE образца (зимой и летом омелы той же самой партии, так как используется для производства APVAE). Для этой цели, контейнер был последовательно заполняется с зимней и летней омелы, которые были сведены вместе, однородно по upending контейнера в 10 раз. Для экспериментов, APVAE и VAE были стерильной фильтрации сразу же после смешивания и заносится в 1 мл в стеклянные ампулы в асептических условий для хранения при температуре 4 с двух сортов омелы были исследованы: экстракты омелы растений, растущих на узел дерева яблоко " (APVAE/VAE Мали) и экстракты омелы растений, растущих на узел дерева сосны (APVAE/VAE Pini).
2.2. Культура КлетокЧеловеческих клеточных линий рака HCC1143 (карциномы молочной железы), па-ту-8902 (аденокарциномой поджелудочной железы), DU-145 (рак простаты), и NCI-H460 (рак легких) были получены от Лейбниц-институт DSMZ-немецкий коллекция микроорганизмов и клеточных культур (Германия). MV3 клеток (метастатической меланомы человека), были любезно предоставлены Анка Даля, университетской клинике Гамбург-Эппендорф (Германия). Все клеточные линии, за исключением па-ту-8902 культивировали в стандартных ячеек культура условия (37 градусов C, относительная влажность 95%, 5% CO2) в RPMI-1640 среднего (Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария) с добавлением 10% инактивированной жарой фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), Sigma-Aldrich, Швейцария), 2 мм L-Глютамина ("Sigma-Aldrich, Швейцария), и пенициллин-Стрептомицин (Sigma-Aldrich, Швейцария; пенициллин 10,000 ед/мл и 10 мг/мл Стрептомицина). Dulbecco's изменен eagle's Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, Швейцария), дополненная вышеперечисленных ингредиентов был используемых для выращивания па-ту-8902. Клетки культивировали в единомышленником, экспоненциальный рост в 25 см.2 культура-термосы (ТЭЦ, Фауст Laborbedarf AG, Швейцария) и клеток, subconfluent монослоя были собраны путем кратковременного воздействия трипсин-раствора ЭДТА (Sigma-Aldrich, Швейцария).
2.3. Рост Клеток АнализаКлетки были посеяны на плотность 2500 клеток в 90 μЛ/а в 96-луночный планшет (ТЭЦ, Фауст Laborbedarf AG, Швейцария) и инкубируют при стандартных условиях в течение 4 часов, чтобы достичь соблюдения дно. После этого клетки были выставлены в течение 48 часов для разных концентраций, соответствующих разведений Viscum album экстракт (VAE Мали, много 1210/2338), anthroposophically обрабатываются Viscum album экстракт (APVAE Мали, много 1210/2339), или чистый носитель (управления) путем добавления объема 90 μЛ/ну, в результате чего общий объем-180 μЛ/хорошо. После 2-дневного инкубационного, ни один из клеточных линиях достиг полного слияния.
В этом анализе, только VAE/APVAE Мали была использована из-за избирательной токсичностью клеточных линий рака, применяемых в отношении омелы лектинов (VAE/APVAE Pini почти лишено омелы лектины). VAE Мали (лот 1210/2338), концентрация 10,400 ± 283 Рост клеток оценивали с помощью колориметрический анализ на основе расщепления tetrazolium соль WST-1 (Рош диагностика, Rotkreuz, Швейцария) formazan по митохондриальной дегидрогеназы в жизнеспособных клеток [22]. Для этого, после 48 Возможные эффекты в зависимости от расположения образцов в 96-луночный планшет были устранены путем систематического обмена образца позиции. Все манипуляции экспериментатором были выполнены с закодированными ("слепой") VAE и APVAE образцов. VAE и APVAE образцы были разбавлены для получения следующих окончательной концентрации экстракты: 800, 600, 400, 200, 100, 50, 25, и 12,5 Жизнеспособность клеток была рассчитана путем установки значений ОП ячейки свободного фона контроля 0% и значений ОП из VAE/APVAE-необработанные клетки до 100%. ED50 определялась для каждого эксперимента по квадратичная регрессия жизнеспособности против концентрации, в том числе концентрации с жизнеспособности > 15% (12.5-200 μг/мл для NCI-H460, DU-145, HCC1143, и MV3 и 12,5-800 μg/mL-для платформы па-ту-8902). Значит, ED50 значения ± стандартное отклонение/ошибка рассчитаны на восемь ED50 ценности, полученные в восемь независимых экспериментов для каждой клеточной линии. ED50 значения для VAE и APVAE сравнивались с помощью т-тест для независимых выборок. Расчеты проводились с помощью Microsoft Excel for Mac 2011 (Версия 14.2.2) и Statistica 4 (Statsoft Inc., Талса, США).
2.4. Морфологические Колхицина Опухоли АнализаСаженцы Lepidium sativum Л. (Ekkharthof, Lengwil, Швейцария) культивировали в темноте при комнатной температуре хроматографии на бумаге (2043, Шляйхер и Schuell, Dassel, Германия) в висит LD-полиэтиленовая пленка, мешки (minigrip, нем, Ostermundigen, Швейцария). За мешок, 16 очищенными семенами были введены хроматографии на бумаге, которая была пропитана 3 мл жидкости, а именно : (i) дистиллированной воды (Büchi, Fontavapor 250, Flawil, Швейцария), (ii) VAE Мали (лот 0404/4141) 2 мг/мл, (iii) APVAE Мали (лот 0404/4142) 2 мг/мл, (iv) VAE Pini (лот 0404/4143) 2 мг/мл, или (v) APVAE Pini (лот 0404/4144) 2 мг/мл. Омелы были разбавлены 1 : 100 в дистиллированной воде (от 200 мг/мл 2 мг/мл). Выращивание жидкости, были двойное кодирование и рандомизированное. Все выращивания жидкостей, колхицин (Calbiochem, EMD химических веществ, Сан-Диего, США) был добавлен в фиксированной концентрации в пределах одного эксперимента (см. ниже).
Рост состояния было зарегистрировано Ксерокопирование сеянцы после 93 ± 4 Общее число семь независимые эксперименты были проведены. В пределах одного эксперимента, каждая экспериментальная группа состояла из 20 мешков, каждый из которых содержит 16 семена, на общую сумму 320 семян по каждому параметру в эксперименте или 11,200 семян в целом. Концентрация колхицина в выращивании жидкость была 17 Применение колхицина, чтобы Lepidium sativum led в зависимости от дозы, укорочение и утолщение стрелять (Рис. 2) и удлинения root. Следовательно, соотношение корень стрелять длина увеличилась за счет колхицина. Поэтому мы определили отношение корень стрелять длины, как главный итог параметр для этой морфологической биопроб. Все данные были проанализированы с помощью статистических программ Statistica 6 (Statsoft Inc., Талса, США). Статистическая оценка основывалась на ANOVA (дисперсионный анализ) процедур. Планируется сравнения были проанализированы с ЛСД, только если тест предыдущего глобального F-тест был значительным (P < 0.05) (protected Фишера (ЛСД). Эта процедура является хорошей гарантией от типа I, а также ошибок второго рода [23]. Статистический анализ проводили с данными из n = 10,612 рассады (данные из 588 рассады (5.25%) отсутствовали, либо из-за неисправной прорастания или за счет исключения во время измерения длины согласно критериям, определенным выше). Параметры обработки были расшифрованы только после измерения длины-была достигнута.
|