В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. 
   Проовоскопировать РКЭ.
   

3. Отметить простым карандашом на скорлупе границу воз­душной камеры, местонахождение эмбриона и безсосудистую зо­ну.

4. Заразить РКЭ на хорион-аллантоисную оболочку, в жел­точный мешок, аллантоисную и амниотическую полости.

Примерный план занятия (2 ч)

1. 
   Контрольный опрос.
   

3. Демонстрация организации рабочего места; овоскопирования и подготовки куриных эмбрионов, заражения; отработки технических приемов заражения РКЭ всеми способами; строение вскрытого эмбриона.

4. Самостоятельная работа студентов: а) овоскопирование двух куриных эмбрионов; б) подготовка к заражению; в) отработ­ка техники заражения всеми методами на одном курином эм­брионе; г) заражение 9-дневного эмбриона вирусом ньюкаслской болезни (штамм "В" или "Н") в аллантоисную полость, подписывание его; д) заражение 11-дневного куриного эмбриона вирусом оспы голубей (кур) на ХАО.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

По теме целесообразно провести два занятия с интервалом в несколько дней с тем, чтобы студенты могли вскрыть зараженные ими эмбрионы. Рекомендуется использовать для заражения вирус ньюкаслской болезни, штамм "В", который в максимальных титрах накапливается к 5-му дню инкубации, не вызывая гибели эмбриона. Овоскопирование удобнее проводить в затемненной комнате. Студенты работают в марлевых масках, которые после каждой группы стирают и стерилизуют.

1. Взаимодействие вирусов в условиях смешанных инфекций

2. Методы вскрытия РКЭ, отбор вируссодержащего материала

3. Получение эмбриональной жидкости для постановки ка­пельной РГА.

4. Патологоанатомические изменения в РКЭ.

5. Цель пассирования вирусов на РКЭ.

Куриные эмбрионы при заражении вируссодержащим мате­риалом не всегда погибают, поэтому их следует выдержать опре­деленное время в термостате или в лабораторном инкубаторе (обычно 5...10 суток, срок зависит от вида вируса). Перед вскры­тием их на 2...3 ч помещают в холодильник при 4...6 °С. При ох­лаждении кровеносные сосуды сокращаются, что предупреждает кровотечение и возможность адсорбции вирусов на эритроцитах в процессе вскрытия эмбриона и отбора вируссодержащего мате­риала. Затем скорлупу в месте воздушной камеры обрабатывают 70%-ным спиртом, обжигают на пламени, снова обрабатывают 0,5%-ной настойкой йода и опять обжигают.

Чтобы получить аллантоисную и амниотическую жидкости, скорлупу стерильными ножницами обрезают на 2...3 мм выше границы воздушной камеры. Яйцо слегка наклоняют, уда­ляют оставшуюся подскорлупную оболочку и через прокол в хорион-аллантоисной оболочке пас­теровской пипеткой, избегая повреждения сосудов, отса­сывают 6...10 мл прозрачной аллантоисной жидкости. После этого пинце­том захватывают эмбрион, пастеровской пипеткой про­калывают амниотическую оболочку и отсасывают амниотическую жидкость (0,5...1,5 мл). Эмбрион при этом необхо­димо передвигать, чтобы не закупоривалась пипетка.

Далее ножницами по кругу (граница воздушной камеры) подрезают хорион-аллантоисную оболочку, удаляют этот ее уча­сток и все содержимое эмбриона извлекают в чашку Петри. Оставшуюся хорион-аллантоисную оболочку помешают в стерильную чашку Петри, тщательно расправляют и макроскопи­чески исследуют на темном фоне. Для этого чашку Петри уста­навливают на черную бумагу. Затем отделяют эмбрион, разрезают оболочку желточного мешка, освобождают ее от желтка, промы­вают физиологическим раствором и также помещают в отдельную чашку Петри.

Материал, взятый из куриных эм­брионов, обязательно проверяют на присутствие бактерий путем высева на МПА, МПБ. Следует иметь в виду, что патологоанатомические изменения за­висят от вида вирусов и метода зара­жения РКЭ. Наиболее характерные изменения локализуются на хорион-аллантоисной оболочке: воспалитель­ные очаги — непрозрачные, бело-серого цвета, часто округлой формы; перламутровые бляшки с некротиче­ским центром; кровоизлияния .

На теле и голове зародыша, оболочке желточного мешка могут быть кровоизлияния, застойные явления в сосудах лапок и крыльев, в некоторых случаях — отставание в росте ("карликовость"), скручивание и отечность. Иногда отмечается увеличение печени кровоизлияния на ее поверхности. Для быстрого обнаружения гемагглютинирующего вируса в исследуемой эмбриональной жидкости (содержимое аллантоисной и амниотической полостей) ставят капельную реакцию гемагглютинации. Для необходимо иметь 5%-ную взвесь эритроцитов кур на физиологическом растворе, предметное или часовое стекло и пас­теровские пипетки.

Техника постановки данной реакции сводится к следующему. На поверхность предметного стекла наносят каплю исследуемой жид­кости и каплю 5%-ной взвеси эритроцитов кур и перемешивают.

В положительном случае реакция наступает через 3...5 мин. Если в жидкости находится гемагглютинирующий вирус, то при взаимо­действии его с эритроцитами обра­зуется агглютинат (происходит агглютинация эритроцитов), а надосадочная жидкость становится прозрачной. Если вирус отсутствует или не обладает гемагглютинирующими свойствами, эритроциты остаются во взвешенном состоянии, жидкость остается мутной.

При выделении и культивировании вирусов на куриных эм­брионах, как правило, проводят несколько (не менее 3) быстро следующих один за другим пассажей. Это позволяет исключить токсичность исследуемого материала, способствует адаптации ви­руса, повышению его вирулентности и более интенсивному про­явлению патологоанатомических изменений в эмбрионах. Для каждого последующего пассажа используют патологический ма­териал предшествующих, обязательно определяют титр (концен­трацию) вируса.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Проовоскопировать зараженные и контрольные РКЭ.

2. Вскрыть РКЭ, собрать вируссодержащий материал, изу­чить патологоанатомические изменения на теле эмбриона, хорион-аллантоисной оболочке (фиксация в 10%-ном растворе фор­мальдегида), оболочке желточного мешка.

3. Поставить капельную РГА.

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация: организации рабочего места для вскрытия эмбриона и получения от него вируссодержащего материала; па­тологических изменений, капельной РГА.

4. Самостоятельная работа студентов: а) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни, отсасы­вание аллантоисной и амниотической жидкостей, постановка ка­пельной РГА; б) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных ви­русом оспы, подсчет количества оспин на ХАО.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Для заражения эмбрионов рекомендуется использовать ви­рус Ньюкаслской болезни, штамм В поскольку он накапливается в максимальных титрах к 5 дню инкубации, не вызывая гибель эмбрионов. Содержащийся в аллантоисной жидкости вирус в ка­пельной РГА образует крупные хлопья эритроцитов. Для отра­ботки метода заражения на ХАО удобно использовать вирус оспы голубей, штамм Нью-Джерси. Гибели эмбрионов он не вызывает, но на ХАО образует довольно крупные "оспины". Для пробивания в скорлупе отверстий могут быть изготовлены пробойники из не­ржавеющей стали. Если их нет, можно использовать инъекцион­ную иглу, вколотую в резиновую пробку. Парафин, предвари­тельно расплавленный, засасывают в пастеровские пипетки, а затем расплавляют на спиртовке, закрывая отверстия в скорлупе.

1. Природа и происхождение вирусов. Основные свойства вирусов, отличающие их от бактерий и других микроорганизмов.

2. 
   Виды культур клеток.
   

4. Подготовка лабораторной посуды.

5. Вода, солевые растворы и питательные среды, применяемые в вирусологической практике.
ЗАНЯТИЕ 9. Принципы культивирования вирусов в культуре клеток

Цель занятия: ознакомиться с общими сведениями о куль­турах клеток, солевыми растворами и питательными средами, рецептурой их приготовления, отработать технику подготовки необходимой посуды при получении культуры клеток.

Оборудование и материалы: среда 199, 5%-ный гемогидролизат, 0,5%-ный гидролизат лактальбумина, 0,25%-ный раствор трипсина, раствор Хенкса, 7,5%-ный раствор соды на бидистиллированной воде, раствор версена, бычья сыворотка и другие сре­ды, смонтированная для стерилизации посуда, пипетки, резино­вые пробки, таблицы по теме.

Краткие теоретические сведения

Культура клеток — это клетки тканей различных органов многоклеточного организ­ма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). При этом в пробирках или матрасах образу­ется клеточный монослой. Культуру клеток практически можно получить из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако, лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как их клетки еще слабо дифферен­цированы и обладают более высокой потенцией роста.

Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способст­вовало откры­тие Эндерсома с сотрудниками (1949), которые продемонстрировали способность вирусов к репродукции в кусочках тканей и клетках in vitro, открытием Дулъбекко и Фогт (1952) методики трипсинизации тканей и полу­чение однослойных культур клеток, открытием Станфорда, в лаборатории Эрла, методики непрерывного культивирования клеток.

Главными нововведениями, упростившими культивирование клеток и способствовавшими распространению метода клеточных культур, были: 1) использование антибиотиков» не повреждающих животные клетки, но предотвращающих загрязнение культур бак­териями; 2) получение из карциномы человека линии клеток (HeLa), способных неопределенно долго расти in vitro и воспри­имчивых к большому числу различных вирусов человека (Gey et al„ 1952; Scherer et al., 1955); 3) разработка Иглом (Eagle, 1960) простой питательной среды, поддерживающей размножение клеток многих типов; 4) усовершенствование методов получения клонов из единичных клеток млекопитающих (Puck et al., 1957).

Наличие клеточных культур и метода количественного опреде­ления вирусов путем подсчета образуемых ими бляшек в равной степени стимулировало развитие двух аспектов вирусологии. Во-первых, в результате клинических и эпидемиологических ис­следований были открыты сотни новых вирусов — так много, что некоторые из них до сих пор не удалось связать с какими-либо известными болезнями (Jackson, Muldoon, 1975). Во-вторых, со­здалась возможность производства вакцин в промышленных мас­штабах. К началу 1960-х годов только против полиомиелита было вакцинировано несколько сотен миллионов человек, и теперь во всех странах заболеваемость полиомиелитом резко снизилась. В клеточных культурах были получены и другие вирусные вакци­ны, например противокоревая, и после успеха профилактики по­лиомиелита они получили широкое применение. Методы получения вирусов в больших количествах оказались полезными и для общей вирусологии, они облегчили очистку вирусов.

В вирусологической практике наиболее широко применяют однослойные культуры клеток. Последние, в зависимости от ис­ходного материала, подразделяют на первичные (получают непо­средственно из органов животных и человека) и перевиваемые (адаптируют первичные культуры к условиям жизни в пробирке). Их получают путем обработки кусочков тканей ферментами (трипсин). Последние распадаются на клетки, которые и выращи­вают в виде одного слоя (монослоя) на внутренней поверхности стекла.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток.

1. Первичные. Их готовят непосредственно перед применением (для длительного культивирования они не пригодны). Их можно получить из различных органов и тканей человека и животных. Однако, лучше это удается сделать из эмбриональных органов. Чаще всего используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных. После соответствую­щей подготовки их измельчают на кусочки размером 1...2 мм и обрабатывают трипсином (такие культуры называют первичнотрипсинизированными). Затем полученную взвесь клеток разли­вают по пробиркам или в другую посуду, заливают питательной средой, инкубируют в термостате и получают монослой клеток. Обычно он формируется через 3...5 дней. Скорость формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Пита­тельную среду меняют по мере ее загрязнения продуктами жиз­недеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7...21 дня.

Из первичных клеток можно получить субкультуры путем снятия их со стекла раствором версена (или смесью версена и тринсина) и ресуспендирования в новой питательной среде. Суб­культуры получают от 2-5 пассажей и очень редко до 8-10. По­следующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.

2. Перевиваемые. Это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды. Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме куль­тивирования. Эта работа проводится в течение многих месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых клеток — результат их генетической изменчивости.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных культур он диплоидный), стабильны в условиях роста в пробирке, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство огра­ничивает их использование при производстве вакцин.

Перевиваемые клетки можно получить как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Примеры таких клеток: ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); НеLа — (рако­вая опухоль шейки матки женщины); Нер-2 (карцинома гортани человека); Нер -3 (лимфоидная карцинома человека) и др.

3. Диплоидные. По сути дела это перевиваемые культуры с двойным (правильным) набором хромосом. В первых 50-60 пассажах такие культуры остаются диплоидными и их широко ис­пользуют для решения ряда теоретических и практических задач биологии (приготовление биопрепаратов для человека, выделение онковирусов и др.). Они весьма жизнеспособны, не подвержены морфологическим изменениям, свободны от спонтанного вирусоносительства и т.д.

Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды и соответствующих питательных сред. Подготовка посуды. Качество посуды имеет важное значение для успешного культивирования клеток вне организма. Лучшей является посуда из боросиликатного или натриевого стекла. Посуда должна быть чистой, обезжиренной, не обладать токсическим действием, абсолютно стерильной.

Предложено много способов обработки посуды и в каждой лаборатории выбирают наиболее подходящий из них. При культивировании клеток особенно большие требования предъявляют подготовке и стерилизации посуды, пробок и других материале Во многих случаях неправильная их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой генерации клеточного монослоя.

При обработке посуды необходимо учитывать высокую чувствительность клеток к токсическому действию солей тяжел металлов. Одним из обязательных условий успешной работы клетками является высокое качество воды. Для ополаскивав посуды используют дистиллированную, а лучше бидистиллированную воду.

Обычно всю посуду, как новую, так и бывшую в употреблении (БУ), помещают в мыльный раствор, а инфицированную — мыльно-феноловый (1% мыльной эмульсии + 5% фенола) на сутки. Затем посуду моют теплой водой и обрабатывают по следующей методике. Погружают на 3 ч в раствор хромпика (на 1л концентрированной серной кислоты добавляют 80 г двухромов кислого калия КзСг207); раствор должен быть желтоват коричневого цвета, если он приобретает зеленое окрашивание значит хромовая кислота восстановилась и раствор непригоден для использования. После обработки в хромпике посуду 5 ч промывают в проточной водопроводной воде, ополаскивают в нескольких сменах дистиллированной воды, сушат, монтируют стерилизуют 1,5...2 ч в сушильном шкафу (170...180 °С). Посуда БУ обрабатывают хромпиком в течение 1 ч и стерилизуют при аналогичных условиях.

NаС1 — 8,0 г, КСl — 4,0 г, MgSO₄ • 7Н₂О — 2,0 г, СаС1₂ — 1,4 г, КН₂Р0₄—0,6 г, глюкозы — 10 г, 0,2%-го фенолрота— 4,0 мл, Nа₂НР0₄ — 0,6 г.

Для определения в солевых растворах и питательных средах концентрации водородных ионов (рН) применяют индикатор фе­ноловый красный (0,002%). Он не оказывает токсического воз­действия на клетки и вирусы. При сдвигах рН в щелочную сторону растворы принимают красно-малиновую окраску, в кислую— желтую. При нейтральном значении рН (7,2...7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых раство­ров и питательных сред используют 7,5%-ный раствор бикарбо­ната натрия NaHCO₃ и 3% -ный раствор уксусной кислоты СН₃СООН. Эти растворы готовят на бидистиллированной воде, стерилизуют кипячением и хранят в холодильнике при 4...6 °С не более месяца.

Чтобы получить однослойную культуру клеток, применяют протеолитические ферменты, разрушающие цитоплазматические мостики между клетками. К таковым относятся трипсин, панкреатин, папаин и др. Наиболее часто используют трипсин в виде 0,25%-ного раствора на фосфатном буфере. Хранят его в замороженном состоянии 6...8 месяцев.

При пересеве перевиваемых клеток с целью отделения их от стекла используют версен (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Он оказывает на клетки более легкое действие, чем трипсин. Механизм действия заключается в том, что он всту­пает в реакцию со стеклом, образуя промежуточное соединение, которое механическим путем отделяет клетки друг от друга.

Естественные питательные среды — это биологические жидкости (сыворотка крови, эмбриональный экстракт, асцитическая жидкость, коровья амниотическая жидкость, тканевые экс­тракты и др.).

Питательные среды из естественных компонентов применяют редко, главным образом для выращивания вновь изо­лированных тканей в начале культивирования и для поддержа­ния очень прихотливых тканей животных.

К полусинтетическим питательным средам относят гемогидролизаты, гидролизат лактальбумина, аминопептид и др.

Лучшей искусственной питательной средой является синте­тическая среда 199. Она содержит 60 компонентов: 10 аминокис­лот, 17 витаминов, 8 минеральных солей, 10 компонентов, вхо­дящих в состав нуклеиновых кислот и др.

Кроме того, среды подразделяются на ростовые и поддер­живающие. Ростовые применяются в 1-ой фазе культивирования клеток. Они богаты питательными веществами и способствуют активному размножению клеток (например, 5%-ый гемогидролизат + 10% бычьей сыворотки). Поддерживающие среды приме­няют во 2-ой фазе культивирования клеток — после заражения культуры клеток вирусами. Они поддерживают жизнеспособность клеток. Из поддерживающих сред обычно исключают сыворотку.

Для уничтожения микрофлоры перед использованием в сре­ды добавляют пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (50 ЕД/мл), тетрациклин (100 ЕД/мл), устанавливают рН 7,2...7,4; в ростовые среды, кроме того, вносят 10% бычьей сыворотки.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо:

1. Ознакомиться с солевыми растворами и питательными средами, рецептурой их приготовления.

2. Отработать технику подготовки посуды для стерилиза­ции;

3. Провести регулировку рН в одном из растворов, пита­тельной среде (раствор Хенкса, 0,5%-ный гемогидролизат или др.).

1. 
   Контрольный опрос.
   
2. 
   Объяснения преподавателя.
   
3. 
   Демонстрация растворов Хенкса, Эрла, трипсина, версена, питательных сред 199, Игла, гидролизаталактальбумина и др, посуды для культивирования клеток.
   
4. 
   Самостоятельная работа студентов.
   
5. 
   Подведение итогов занятия.
   
6. 
   Задание к следующему занятию.
   

На занятии необходимо иметь набор солевых и прочих рас­творов, питательных сред. Очень хорошо демонстрировать фикси­рованные препараты культур клеток или диапозитивы с после­дующей их зарисовкой в рабочую тетрадь.

1. Патогенез вирусных инфекций.

2. Получение первично-трипсинизированных культур кле­ток.

3. Техника подсчета и разлива клеток.