Дифференцировка и поведение нейральных стволовых клеток человека в культуре ткани и при трансплантации в головной мозг крыс

Аналогичные наблюдения были сделаны и другими исследователями в культурах клеток, выделенных из костного мозга (Sanchez-Ramos, 2002; а также собственные наблюдения). Эти и многие другие наблюдения показывают, что белок нестин играет существенную роль в организации ансамблей промежуточных филаментов у недифференцированных клеток разных органов и тканей.

В заключении хотелось бы отметить следующий тезис. Тот факт, что по данным настоящего исследования и литературным данным нейросферы гетерогенны, позволяет по-новому взглянуть на проблему нейральных стволовых клеток в целом. В этом случае нейросферы можно рассматривать как «нишу» стволовых клеток in vitro, поскольку их составляют практически те же типы клеток, что и нейрогенные кластеры нативного мозга.
Трансплантация популяций нейральных стволовых/прогениторных клеток эмбрионального мозга человека в головной мозг взрослых крыс.

В настоящей работе были проведены трансплантации культур НСПК человека в головной мозг нормальных крыс и крыс, подвергнутых острой гипоксии. Было сделано две серии экспериментов. В первой серии проводили исследования, направленные на изучение вопроса о переживании трансплантированных популяций НСПК эмбрионального мозга человека в мозгу крыс, подвергнутых острой гипоксии, и влиянии нейротрансплантации на когнитивные функции этих животных. В этой серии исследования проводились на четырех группах экспериментальных животных: 1) с острой гипоксией (группа Г, n=5); 2) с острой гипоксией и трансплантацией культуры НСПК (группа Г+НСПК, n=7); 3) с острой гипоксией и введением физиологического раствора (Г+ФР, n=6); 4) нормальные животные (группа Н, n=5).

Через сутки после сеанса гипоксии животным производили трансплантацию культуры НСПК (группа Г+НСПК), которую выращивали в течение 65 дней в присутствии ЭФР, ФРФ-2 и ЛИФ, или инъецировали физиологический раствор (группа Г+ФР). На 4-ые сутки после сеанса гипоксии крыс обучали условному рефлексу двустороннего избегания (УРДИ) в «челночной камере». Через 9 и 23 суток после сеанса гипоксии проводили проверку закрепления рефлекса. Поведенческие тесты проводили в лаборатории функциональной нейроморфологии Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (руководитель лаборатории д.б.н. Лосева Е.В.). Объединенные показатели двух тестов (на 9-й и 24-й дни после сеанса острой гипоксии) для групп Г, Г+ФР и Г+НСПК и 2-го теста для группы Н представлены на Рис. 13. В контрольной группе Н крысы статистически значимо (Р<0.05) лучше обучались УРДИ по сравнению с крысами из других групп, включая группу Г+НСПК. Животные из группы Г+НСПК статистически значимо (Р<0.05) лучше обучались УРДИ по сравнению с животными из группы Г+ФР. Этот эффект менее выражен при сравнении группы Г+НСПК с группой Г, где животные были подвергнуты только острой гипоксии. Статистически достоверной разницы не выявлено, однако наблюдалась выраженная тенденция (Р<0.1).

Через 27 дней после трансплантации (или через 28 дней после сеанса гипоксии для группы Г) проводили гистологические и иммуногистохимические исследования мозга экспериментальных и контрольных животных. Трансплантаты клеток человека были расположены в коре, гиппокампе и таламических отделах мозга (Рис. 8). Была выявлена миграция клеток от трансплантатов в области неокортекса и гиппокампа. В коре мозга клетки человека мигрировали в III-V слои, нейроны которых наиболее подвержены влиянию гипоксического повреждения. В гиппокампе трансплантированные клетки мигрировали по субпирамидному слою. Пересаженные клетки мигрировали как по паренхиме мозга, так и по кровеносным сосудам. Спустя 27 дней после пересадки трансплантированные клетки человека способны митотически делиться. Так, при двойной окраске препаратов антителами против hNuc и нестина были выявлены митотические фигуры среди нестин-позитивных клеток (Рис. 9В). Окраска антителами против Ki67 показала, что в отличие от нейросфер in vitro во всех трансплантатах обнаруживались только единичные клетки, окрашивающиеся на этот белок (Рис. 9А). Это указывает на снижение пролиферативной активности клеток после трансплантации.

Иммуногистохимическая окраска на нестин человека выявила множество клеток в трансплантатах, иммунопозитивных к этому белку (Рис. 10А). В зонах контакта трансплантата с мозгом реципиента отростки нестин-иммунопозитивных клеток глубоко врастали в прилежащую ткань. Похожая картина наблюдается при окраске антителами против виментина (Рис. 10В). β-тубулин III иммунопозитивные клетки равномерно распределялись по трансплантатам и имели, как правило, биполярную форму с небольшими отростками. На препаратах среди нестин-позитивных клеток было четко видно множество нейробластов, которые имели более короткие отростки, мало выходящие за пределы трансплантатов (Рис. 11А).

Окраска с использованием антител к ГФКБ позволила показать, с одной стороны, реакцию астроцитов реципиента, с другой, глиальную дифференцировку клеток в трансплантатах. Двойная иммуногистохимическая окраска антителами против hNuc и ГФКБ позволила выявить в трансплантатах отдельные группы, состоящие из 5-10 клеток, окрашивающиеся на оба маркера (Рис. 11В).

Двойная иммуногистохимическая окраска антителами к нестину, которая позволяла полностью выявлять область трансплантата культуры НСПК, и белку NeuN, маркеру дифференцированных нейронов свидетельствовала о том, что в трансплантатах отсутствуют дифференцированные нейроны.

Формирования плотного глиального рубца вокруг трансплантата выявлено не было. Однако незначительная глиальная реакция присутствует (Рис. 12). Эта реакция не препятствует реципрокному росту волокон клеток трансплантата и хозяина. Так, при окраске антителами против нестина человека было обнаружено, что клетки трансплантата, окрашивающиеся этими антителами и расположенные на границе трансплантат-хозяин, часто распространяют свои отростки глубоко в паренхиму мозга реципиента. С другой стороны, волокна нейронов мозга хозяина, окрашивающиеся антителами против нейрофиламентов, проникают в ткань трансплантата.

Таким образом, полученные гистологические данные показывают успешное переживание трансплантатов НСПК в мозгу гипоксированных крыс. Однако эти данные не указывают на возможность функциональной интеграции трансплантатов. Таким образом, возникает вопрос: с чем связан эффект улучшения обучения УРДИ в группе гипоксированных животных получивших трансплантат по сравнению с контрольными группами? Было сделано предположение о том, что трансплантат НСПК за счет трофического действия может обеспечивать лучшую выживаемость собственных нервных клеток реципиентов. Для проверки этого предположения был сделан морфометрический анализ нормальных и дегенерирующих нейронов в мозгу у крыс разных групп. При статистической обработке данных, полученных путем подсчета трех типов нейронов (нормальных, сморщенных и отечных), была показана существенная разница в их процентном содержании в группах крыс Н, Г+ФР и Г+НСПК (Рис. 14). Это свидетельствуют о генерализованном нейропротективном действии трансплантата.

Во второй серии исследования были направлены на проведение сравнительного анализа переживания культуры НСПК после трансплантации в мозг нормальных крыс и крыс, подвергнутых острой гипоксии. Для трансплантации использовали культуру, выращенную в течение 25 дней в присутствии двух факторов ЭФР и ФРФ-2. Были использованы две группы экспериментальных животных: 1) интактные крысы, получившие трансплантат культуры НСПК человека (n=4) и 2) подвергнутые острой гипоксии крысы, которым через сутки после сеанса гипоксии трансплантировали культуру НСПК человека (n=4). Животных фиксировали через 10 и 20 дней после трансплантации.

В этой серии экспериментов не было выявлено существенных различий между переживанием клеток в интактном и патологическом мозгу. Здесь обращает на себя внимание то, что клетки пересаженной культуры в значительной степени дегенерировали в независимости от того: переживали они в интактном или патологическом мозгу. Окраска антителами против маркеров различных этапов нейральной дифференцировки показала, что во всех случаях в областях, где располагались трансплантированные клетки, обнаруживалась четкая окраска на нестин человека. Также выявлялись клетки, иммунопозитивные к виментину. При окраске антителами против β-тубулина III ни в одном случае не было выявлено клеток в трансплантатах, иммунопозитивных к этому белку. В тоже время, как показали исследования этой культуры перед трансплантацией, β-тубулин III положительные клетки присутствовали в суспензии в значительном количестве. Эти наблюдения указывают на то, что после трансплантации нейробласты резорбировали, и, кроме того, не происходило новой генерации клеток с нейрональной дифференцировкой. Аналогичная ситуация и с глиальными клетками. По-видимому, этот результат в большей степени зависел от самой культуры и условий предварительного культивирования, нежели от условий переживания в нормальном или поврежденном мозгу.

Тот факт, что в первой серии экспериментов у гипоксированных крыс, получивших трансплантат, происходит нормализация поведения в виде тенденции (p<0.1), по-видимому, связан с незначительной выборкой в экспериментальной группе. Однако если рассматривать более детально результаты по каждой крысе в отдельности, то в группе Г единственная крыса достигла заданного критерия выработки УРДИ только 3-ем тесте. В тоже время, в группе Г+НСПК две крысы стабильно достигали заданного критерия выработки УРДИ во 2-ом и 3-ем тестах. Улучшение когнитивных функций после трансплантации популяций НСПК у животных с экспериментальной дисфункцией гиппокампа было также продемонстрировано в работе Джелша с соавт. (Jeltsch et al., 2003). Это улучшение связано с нейропротективным действием трансплантированных клеток, что также ранее также было продемонстрировано на других моделях повреждения мозга у животных (Hagan et al., 2003; Akerud et al., 2001).

Используя иммуногистохимический метод, удалось получить убедительные доказательства того, что клетки из культуры НСПК эмбрионального мозга человека переживают без признаков отторжения как минимум 27 дней. Трансплантаты включают популяции недифференцированных стволовых и прогениторных клеток, а также клеток с нейрональной и глиальной дифференцировкой. Это согласуется с многочисленными литературными данными (Friker et al., 1999; Vescovi et al., 1999; Rubio et al., 2000; Englund et al., 2002a; Jain et al., 2003a). В тоже время, терминально дифференцированных нейронов, которые окрашивались бы антителами против NeuN, в трансплантатах выявлено не было. Это с одной стороны показывает, что функциональной интеграции трансплантированных клеток в нейронную сеть хозяина на данном сроке переживания не происходило, а с другой – подтверждает выводы других исследователей о том, что клетки человека сохраняют свои собственные темпы дифференцировки после трансплантации в мозг крыс (Friker et al., 1999).

Снижение пролиферативной активности клеток после трансплантации можно обосновать с позиций взаимодействия трансплантированных клеток с микроокружением тканей мозга хозяина. Факторы микроокружения дифференцированного мозга либо оказывают влияние на клеточный цикл, удлиняя его период, либо заставляют клетки выйти из клеточного цикла в фазу покоя.

Результаты второй серии экспериментов показали, что существенной разницы в переживании трансплантированной культуры НСПК в мозгу нормальных и гипоксированных крыс не наблюдается. Однако в этом случае была выявлена значительная дегенерация трансплантатов у всех животных. Можно сравнить эти результаты с результатами экспериментов первой серии. Необходимо напомнить, что в первой серии была использована культура НСПК, выращенная в течение 65-ти дней по специальному протоколу с тремя митогенами: ФРФ-2, ЭФР и ЛИФ. Во второй серии экспериментов культуру НСПК человека растили 25 дней в среде с двумя митогенами: ФРФ-2 и ЭФР. Не смотря на то, что при культивировании по обоим протоколам формируются нейросферы, на переживание и развитие трансплантатов, по-видимому, влияют способы сохранения клеток в культуре. В литературе отсутствуют какие-либо данные по этому вопросу. Однако результаты нескольких исследований культур НСПК in vitro явно показывают, что именно при выращивании клеток в среде с тремя митогенами (ФРФ-2, ЭФР, ЛИФ) достигаются наибольшие темпы роста клеточной популяции, и клетки такой популяции дифференцируются преимущественно в нейроны (Carpenter et al., 1999; Svendsen et al., 1999; Wright et al., 2003). Более того, ЛИФ необходим для длительного сохранения популяций НСПК в культуре. Исходя из данных настоящего исследования, можно предположить, что длительное культивирование с ЛИФ приводит к более успешному приживлению трансплантатов популяций НСПК в мозгу крыс.
Трансплантация клеток ненейрального происхождения в головной мозг взрослых крыс.

Анализ адгезивной культуры МСК человека дал следующие результаты. Все клетки на препаратах были иммунопозитивны к виментину. Среди них встречались единичные клетки, выявляемые антителами против нестина. Почти все клетки в исследованной культуре обнаруживают экспрессию фибронектина, за исключением единичных клеток. Интересно, что среди фибронектин-иммунопозитивных клеток можно выявить клетки, окрашивающиеся антителами против нестина. При окраске антителами против маркеров нейрональной и глиальной дифференцировки, β-тубулину III и ГФКБ, клеток, иммунопозитивных к этим маркерам, выявлено не было. Таким образом, перед трансплантацией культура МСК человека не содержала клеток с нейрональной и глиальной дифференцировкой.

Через 10 дней после трансплантации клетки из культуры МСК человека были выявлены с использованием антител против белка hNuc у всех животных, как в группе норма+трансплантация МСК (n=3), так и в группе гипоксия+трансплантация МСК (n=3) (Рис. 15A,C). Основная масса трансплантированных клеток располагалась, как правило, в стриатуме. В неокортексе и белом веществе обнаруживались единичные клетки. Миграции клеток по тканям мозга реципиента не наблюдалось. Во всех случаях клетки были окружены скоплением макрофагов. Через 20 дней после трансплантации единичные hNuc-иммунопозитивные клетки были выявлены у одной нормальной крысы (группа норма+трансплантация МСК; n=3) и у одной крысы с острой гипоксией (группа гипоксия+трансплантация МСК; n=3) (Рис. 15B,D). Здесь также обнаруживались значительные скопления макрофагов в области трансплантации. Таким образом, к 20-му дню происходила полная элиминация трансплантированных клеток.

В случае 10-ти дней переживания внутри трансплантатов была выявлена положительная окраска антителами против виментина. Это показывает, что клетки сохраняют экспрессию этого белка после трансплантации. В тоже время виментин-позитивные клетки обнаруживались вокруг трансплантатов, что свидетельствует о развитии глиальной реакции. Эти данные в дальнейшем были подтверждены при окраске антителами против ГФКБ (см. ниже). Положительной окраски на нестин человека, β-тубулин III и ГФКБ трансплантированные клетки не обнаруживали. Это свидетельствует об отсутствии дифференцировки клеток из культуры МСК человека в нейральном направлении после трансплантации.

Помимо виментина клетки трансплантатов окрашивались на фибронектин. При двойной окраске антителами против hNuc и фибронектина было обнаружено, что область трансплантата почти целиком иммунопозитивна к фибронектину (Рис. 16). Гистологическая картина при такой окраске указывает на то, что в области трансплантатов развился мощный внеклеточный матрикс. По-видимому, этот матрикс приводит к сильному морфологическому изменению окружающих тканей, что находит подтверждение при простой гистологической окраске крезилвиолетом.

Вокруг трансплантатов МСК была обнаружена выраженная глиальная реакция астроцитов хозяина (Рис. 17). Реактивный глиоз распространялся на значительное расстояние от трансплантатов. В этом случае на себя также обращает внимание измененная морфология окружающих тканей. Волокна реактивных астроцитов ориентировались радиально по направлению к трансплантатам.

При окраске антителами против нейрофиламентов было обнаружено, что волокна нейронов хозяина глубоко врастали в область трансплантатов в разрывы между скоплениями макрофагов (Рис. 18). По-видимому, такому росту способствовал фибронектиновый внеклеточный матрикс.

Анализ культуры МСК взрослого человека во многом подтверждает сделанные ранее наблюдения других исследовательских групп (Piersma et al., 1985; Li et al., 1995; Takahashi et al., 1995). В частности популяция МСК является достаточно гомогенной по маркерам к виментину и фибронектину. Единичные клетки в культуре окрашивались антителами против нестина. Похожие результаты получили Вислет-Гендебен с соавт. (Wislet-Gendebien et al., 2003). Ими было также продемонстрировано, что количество клеток, иммунопозитивных к нестину, увеличивается, если культуру МСК перевести на бессывороточную среду. В этих условиях клетки растут в виде свободно плавающих агрегатов. Однако, при помещении нестин-положительных агрегатов в условия среды, где они прикрепляются к подложке, клетки в них никогда не дифференцируются по нейральному пути. Таким образом, экспрессия нестина в культурах МСК отражает функциональное состояние клетки, нежели указывает на ее потенции к нейральной дифференцировке.

При окраске антителами против β-тубулина III и ГФКБ, маркеров нейрональной и глиальной дифференцировки, клеток, иммунопозитивных к этим белкам, выявлено не было. Эти данные противоречат некоторым исследованиям, в которых авторы указывают, что в нативных культурах МСК встречаются клетки с нейральной дифференцировкой. В частности, Тондре c соавт. (Tondreau et al., 2004), используя методы проточной цитофлуориметрии, полимеразной цепной реакции и Вестерн блот анализа, показали наличие белков-маркеров нейральной дифференцировки в клетках из культур МСК. Однако в настоящем исследовании условия иммуногистохимического окрашивания были аналогичны тем, в которых окрашивали культуры НСПК эмбрионального мозга человека. Поэтому отсутствие позитивной окраски на β-тубулин III и ГФКБ в культуре МСК человека можно считать достоверной.

Анализ результатов трансплантации культуры МСК человека в целом свидетельствует о прогрессирующей резорбции трансплантатов, что противоречит результатам некоторых исследований (Azizi et al., 1998; Kopen et al., 1999), где было продемонстрировано длительное переживание клеток культур МСК после трансплантации в мозг. На процессы резорбции трансплантатов также указывают плотный слой макрофагов, окружающих трансплантат, и выраженная глиальная реакция. Аналогичные наблюдения сделали Kawaja и Gage (Kawaja and Gage, 1992) в похожем эксперименте с трансплантацией фибробластов кожи. Таким образом, в отличие от клеток популяций НСПК клетки культуры МСК не способны длительно переживать в мозгу после трансплантации. Причиной тому может являться иммунокомпетентность клеток культуры МСК. Кроме этого, в настоящей работе в области трансплантата была выявлена положительная окраска антителами против фибронектина, что было обнаружено также в других исследованиях по трансплантации культур МСК и фибробластов (Kawaja and Gage, 1992; Azizi et al., 1998). По-видимому, присутствие внеклеточного фибронектина оказывает сильное влияние на окружающие ткани мозга реципиента, что приводит к морфологическому изменению структуры нервной ткани в области трансплантатов и провоцирует формирование глиального рубца. В тоже время был обнаружен интересный факт, что волокна нейронов реципиента глубоко врастали в область трансплантатов. Аналогичные наблюдения сделали Ньюхабер с соавт. (Neuhuber et al., 2005). В этом случае при пересадке клеток культур МСК в травмированный спинной мозг авторы выявили активный рост поврежденных аксонов через область трансплантата.

Автор выражает благодарность своим коллегам за помощь в подготовке экспериментального материала для настоящей диссертации: руководителю лаборатории клинической иммунологии Центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН академику РАМН профессору Сухих Геннадию Тихоновичу и его сотрудникам за подготовку культур НСПК эмбрионального мозга человека, руководителю лаборатории стромальной регуляции иммунитета Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН д.б.н. Чайлахяну Рубену Карповичу и его сотрудникам за подготовку культур МСК человека, руководителю лаборатории функциональной нейроморфологии Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН д.б.н. Лосевой Елене Владимировне и ее сотрудникам за проведение поведенческих тестов.

Настоящая работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №02-04-48153, РФФИ №05-04-48031 и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.