Дипломная работа студентки 5 курса факультета кинологии Академии им. К. А. Тимирязева Лобачевой Анны Львовны
Препараты, используемые при искусственном осеменении
жүктеу/скачать 453.34 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Оценка эякулята.
- Хранение спермы.
- 2. Собственные исследования. 2.1. Цель и задача исследования
- 2.2. Методика и материалы исследования
- Табл.2 Схема опыта.
|
Препараты, используемые при искусственном осеменении. По безвредности препараты подразделяют на абсолютно безвредные (глюкоза, цитрат натрия и др.), безвредные (лактоза и др.), относительно безвредные (хлорид натрия, бикарбонат натрия и др.), условно безвредные (трис буфер, глицерин, антибиотики и др.), и вредные (спирт, перекись водорода и др.). В практике искусственного осеменения используют вещества, относящиеся к первым четырем группам. Абсолютно безвредные, безвредные и относительно безвредные препараты можно использовать в изотонических концентрациях, условно безвредные вводят в состав сложных искусственных сред в небольших количествах, чтобы повысить устойчивость спермиев к действию различных внешних факторов - замораживанию, контаминации микроорганизмами и др. Оценка эякулята. Сперму получают только от здоровых, физиологически зрелых самцов в манеже с соблюдением ветеринарно-санитарных правил и не более 2-3 раз в неделю. При этом в дозе криоконсервированной спермы должно содержаться не менее 150-200 млн. подвижных сперматозоидов. В процессе замораживания погибают 40-50% сперматозоидов. Поэтому, в среднем за неделю, от одного производителя можно заготовить замороженной спермы, достаточной для плодотворного осеменения только 1-2 сук. Более интенсивное использование самцов-производителей приводит к половому истощению и ухудшает качество спермы. Для хранения спермы в замороженном состоянии от собак получают 2 эякулята с перерывом 1-2 ч (в неделю). Качество спермы оценивают сразу же после ее получения. Сперму исследуют макро- и микроскопически. При макроскопическом исследовании определяют ее объем, цвет, запах и консистенцию; при микроскопическом - активность спермиев, их концентрацию, процентное соотношение нормальных и патологических форм. В норме сперма собак консистенции и цвета обезжиренного молока, без запаха. Сперму с неприятным запахом, загрязненную кровью (гемоспермия), мочой (уреспермия), гноем (пиоспермия) выбрасывают. При выделении такой спермы самца-производителя тщательно обследуют, назначают соответствующее лечение и не допускают к использованию до полного выздоровления. Активность спермиев определяют под микроскопом при температуре 38-39ºС , используя специальный обогревательный столик. На чистое предметное стекло наносят каплю спермы и накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю исследуют под микроскопом в неярком свете при увеличении в 200-300 раз. Сперму оценивают визуально по десятибалльной шкале, определяя количество спермиев с прямолинейно-поступательным движением. Высшую оценку 10 баллов получает сперма, в которой практически все спермии двигаются прямолинейно-поступательно. При оценке в 9 баллов примерно 90% спермиев двигаются прямолинейно-поступательно. При оценке 8 баллов примерно 80% спермиев двигаются прямолинейно-поступательно, при оценке 5 баллов - 50% и т.д. Сперму, не содержащую спермиев, обозначают буквой А (аспермия), с мертвыми спермиями - буквой Н (некроспермия). Нормальная активность спермиев собаки составляет 7-10 баллов. Концентрация спермы - показатель, который определяют при помощи счетной камеры Горяева, используемой для подсчета эритроцитов и лейкоцитов (наиболее простой и достаточно надежный способ), а также при помощи фотоэлектрического колориметра или автоматического счетчика клеток. Камера Горяева состоит из толстого предметного стекла, разделенного поперечными прорезями на три площадки. Средняя площадка ниже боковых на 1/10 мм и разделена продольной прорезью на две части, на каждой из которых выгравирована сетка. Каждая сетка состоит из 225 больших квадратов, из них 25 разделено на 16 маленьких квадратиков. Площадь маленького квадратика составляет 1/400 мм². Для подсчета спермиев пробу спермы предварительно разбавляют 3%-м раствором хлорида натрия. В гипертоническом растворе хлорида натрия спермии становятся неподвижными (погибают), это облегчает подсчет. Сперму разбавляют в 100 раз при помощи эритроцитарного меланжера. Для этого в меланжер вначале набирают сперму до отметки 1, затем раствор хлорида натрия до отметки 101. Чтобы равномерно смешать сперму с раствором, концы меланжера зажимают между большими и указательными пальцами и встряхивают в течение 2-3 минут. Из пипетки меланжера удаляют первые 4 капли, не содержащие спермиев. Следующую каплю вносят под заранее притертое шлифованное стекло. Заряженную камеру Горяева кладут на столик микроскопа и исследуют под большим увеличением. Спермии подсчитывают в пяти больших квадратах (8 малых) по диагонали. Считают только головки спермиев, расположенных внутри малых квадратиков, а также на их левых и верхних линиях. Число спермиев, подсчитанных в пяти больших квадратах, суммируют и делят на 200. При делении получается цифра, выражающая содержание спермиев (млрд. в мл.). Концентрация спермы собак может сильно варьировать от 25 млн до 400 млн клеток в 1 мл. По этой причине качество спермы оценивают не по ее концентрации, а по числу активных спермиев в эякуляте. Ценным показателем служит процентное соотношение нормальных и патологических форм спермиев. Чтобы определить их соотношение, наносят на край обезжиренного, сухого, чистого и теплого предметного стекла 1 каплю спермы и 2-3 капли 0,9%-го раствора хлорида натрия. Капли быстро перемешивают стеклянной палочкой и делают при помощи шлифованного стекла тонкий мазок. Мазок высушивают, фиксируют несколько минут 96%-м спиртом и окрашивают не менее 5 минут 1-2%-м раствором эозина. Раствор краски готовят на 2,9%-м растворе цитрата натрия. Краску на стекле смывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Просохший мазок просматривают под микроскопом при увеличении в 400-600 раз и подсчитывают в нескольких полях зрения не менее 200 спермиев. Число нормальных и патологических форм спермиев по каждому полю зрения суммируют и определяют их процентное соотношение. К патологическим формам спермиев относят: гигантские, карликовые, с деформацией головки, с двумя головками, с надломом шейки и ее эксцентричным креплением к головке, изолированные головки, с искривленным и закрученным хвостом, с двумя хвостами, с цитоплазматической каплей и т.д. В нормальной сперме собак удельный вес патологических форм спермиев не должен превышать 30 %. Хранение спермы. Собак осеменяют свежеполученной, охлажденной (сохраняют при температуре 2-5º С) и замороженно - оттаянной спермой. Свежеполученную сперму используют сразу же после оценки ее качества. К использованию допускают эякуляты, содержащие не менее 60 млн активных спермиев. Наилучшие результаты получают при содержании в спермодозе не менее 200 млн активных спермиев. Охлаждение - наиболее отработанный способ хранения спермы вне организма. Для разбавления и кратковременного хранения спермы собак используют молочную и цитратно-желточную среду. Молочная среда. Свежее цельное или лучше обезжиренное коровье молоко - 200 мл, пенициллин и (или) стрептомицин - 0,05-0,1 г. Молоко берут от клинически здоровых коров с отрицательными результатами исследований на туберкулез, лептоспироз, бруцеллез, а также мастит. Желательно подобрать коров, продуцирующих молоко низкой жирности, поскольку молочные жировые икринки значительно затрудняют оценку качества разбавленной спермы. Молоко обязательно подогревают на водяной бане в течение 10 минут при температуре 92-96 градусов для разрушения некоторых его белков, оказывающих на спермии токсическое действие. Затем молоко процеживают через 3-4 слоя стерилизованной марли, охлаждают до 35-39 С и добавляют антибактериальный препарат. Цитратно-желточная среда. Цитрат натрия трехзамещенный пятиводный - 2,32 г, свежий желток куриного яйца - 20 мг, пенициллин и (или) стрептомицин - 0,05- 0,1 г, вода дистиллированная (бидистиллированная) - 80 мг. Навески цитрата натрия вносят в чистую стерильную колбу. Вливают в колбу прокипяченную и остуженную дистиллированную воду; фильтруют, добавляют антисептик и желток куриного яйца. Перед извлечением желтка скорлупу яйца обеззараживают при помощи бактерицидной лампы или спиртового ватного тампона. Среды готовят непосредственно перед получением спермы. Последнюю разбавляют сразу же после оценки ее качества. Температура спермы и среды должна быть одинаковой, чтобы предупредить температурный шок спермиев. Разбавляют сперму в градуированном смесителе, при этом среду добавляют небольшими порциями. После добавления каждой порции смеситель вращают, чтобы равномерно смешать среду и сперму. Разбавленную сперму медленно охлаждают и хранят при температуре 2-5 С до 4-5 суток. В первые сутки хранения оплодотворяющая способность охлажденной спермы соответствует свежеполученной, на 4-е сутки она лучше, чем замороженно-оттаянная. Криоконсервация, или замораживание - самый перспективный способ хранения спермы вне организма. Впервые собаку успешно осеменили замороженно-оттаянной спермой в 1969 году в США. Методические основы замораживания и хранения спермы собаки и быка одинаковы. Сперму разбавляют в 4-9 раз приопротектной средой (до концентрации не менее 40-80 млн активных спермиев в 1 мл). В качестве приопротектной среды обычно используют трис-буферный разбавитель, содержащий 20% желтка куриного яйца, 4-10% глицерина, или же лактозо (11%)-желточно (20%)-глицериновую (4-16%) среду. Сперму кобелей обычно замораживают в виде гранул объемом 0,2 мл, полипропиленовых соломинках (пайетах) объемом 0,5 - 1 мл или ампулах объемом 1 мл, в парах жидкого азота или на блоках твердого диоксида углерода (-79 С) и хранят в жидком азоте (-196 С). Сперму в соломинках размораживают на водяной бане (при температуре 38-40 С) в течение 30 с, а сперму, замороженную в гранулах, при 37 С в изотонических растворах. Активность размороженной спермы собак обычно составляет 6-7 баллов. Сперму активностью ниже 4 баллов не используют. Результативность осеменения собак замороженно-оттаянной спермой оставляет желать лучшего, и поэтому криоконсервирование спермы собак практикуют редко, хотя в настоящее время центры по криоконсервации спермы собак работают во многих странах мира и используют практически одинаковые методы ее глубокого замораживания, но при этом применяют различные синтетические разбавители, в том числе и патентованные. На сегодняшний день замороженная сперма собак экспортируется в страны Европы, Скандинавии, Северной Америки и Австралии. По данным Американского клуба собаководов, в период с 1981 по 1991 г. От самок, осемененных замороженно-оттаянной спермой, получили всего 240 пометов. 2. Собственные исследования. 2.1. Цель и задача исследования Цель исследования: оценить эффективность искусственного и естественного (ручная вязка) осеменения собак. 2.2. Методика и материалы исследования Работа выполнена на базе ветеринарной клиники при Московской сельскохозяйственной академии им. К.А.Тимирязева на протяжении 12 месяцев с февраля 2003 по март 2004 г. Объектом исследования служили 10 клинически здоровых и физически развитых сук различного возраста породы Среднеазиатская овчарка. До момента включения собак в настоящий эксперимент от каждой из них было получено от 1 до 2х пометов. Условия кормления и содержания собак были примерно одинаковые (кормами натурального происхождения). Примерный состав рациона описан в приложении 1. В соответствии с целью исследования собак разделили на две группы - опытную (n=5) и контрольную (n=5) . животных опытной группы осеменяли искусственно. Контрольную группу - естественным образом (ручная случка). Сук осеменяли спермой одного и того же кобеля-производителя. Методика выбора времени осеменения животных опытной и контрольной групп была одинаковая: время осеменения планировали по дате начала течки. Время проведения осеменения у сук опытной и контрольной группы определяли по дате начала течки. В зависимости от степени выраженности признаков течки и половой охоты первое осеменение сук опытной и контрольной групп производили на 11-13 день от начала течки. Второе - соответственно через 48 часов. До включения в опыт от кобеля было получено 2 эякулята с перерывом 7 дней для оценки его качества. Сперму получали методом мастурбации по методике, описанной в разделе "Обзор литературы". Объем неразделенного на фракции эякулята колебался от 12 до 20 мл., активность спермы была не ниже 6 баллов, процент патологических форм спермиев не превышал 30%, суммарное число активных спермиев в эякуляте достигало 150 - 200 млн. Естественное осеменение (ручную случку) собак контрольной группы проводили по общепринятой методике. Для искусственного осеменения сук сперму от кобеля-производителя получали непосредственно перед проведением искусственного осеменения. Для их осеменения использовали вторую и частично третью фракции спермы. Набор для осеменения состоял из одноразовых инструментов: шприца на 20 мл. и полистеролового катетера, применяемого для катетеризации мочевого пузыря собак. Суку фиксировали в наклонном положении. Половую петлю обрабатывали антисептическим раствором (лизонин), обильно орошали однопроцентным стерильным раствором бикарбоната натрия и высушивали стерильной салфеткой. Под контролем пальцев катетер вводили по верхней стенке влагалища на максимально возможную глубину. К катетеру присоединяли шприц со спермой и нажатием на поршень ее медленно вводили в краниальную часть влагалища. После извлечения катетера большой палец руки вводили во влагалище на 10 минут для имитации полового замка. Результативность осеменения сук опытной и контрольной групп определяли по частоте наступления беременности (в процентах) и размеру полученного от них помета. Диагностику беременности проводили трансабдоминальной пальпации на 45-50 день после осеменения. Полученный цифровой материал подвергли статистической обработке. Результаты исследования представлены в процентах и средними величинами и их стандартными ошибками М +m. Схема опыта приведена ниже. Табл.2 Схема опыта. Схема опыта. Эффективность естественного (ручная вязка) и искусственного осеменения собак породы СРЕДНЕАЗИАТСКАЯ ОВЧАРКА.
жүктеу/скачать 453.34 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
| ||||||||||||||