Реакцияның негізгі компоненттері

Реакцияның негізгі компоненттері

• Реакцияның негізгі компоненттері
• - ДНҚ-полимераза: ДНҚ-полимераза ферменті процестің шешуші элементі болып табылады. Бұл молекула ДНҚ тізбегінің репликациясына қатысады және оның рөлі трифосфат дезоксирибонуклеотидтерді комплементарлы заттармен жұптастырып, жаңа тізбекті синтездеу болып табылады.
• ДНҚ-да тиминдер (Т) адениндермен (А) екі сутектік байланыс арқылы жұптасады, ал цитозин (С) мұны гуанинмен (G) үш көпір арқылы жасайды.
• - Нуклеотидтер: Sanger секвенирлеу нуклеотидтердің екі түрін қамтиды, төрт 2'-дезоксинуклеотидтер (dATP, dGTP, dCTP және dTTP деп қысқартылған) және төрт дидексинуклеотидтер (ddATP, ddGTP, ddCTP және ddTTP).
• Дидексинуклеотидтер ДНҚ құрамына енетін мономерлерге ұқсас болғанымен, олардың құрылымында -OH тобы жетіспейді. Бұл тізбекке жаңа нуклеотидті қосу мүмкін емес етеді.
• Демек, түзілу тізбегіне арнайы нуклеотид - мүлдем кездейсоқ жолмен қосылған кезде, синтез парализге ұшырайды. Сонымен, реакцияның соңында әртүрлі мөлшердегі тізбектер болады, олардың әрқайсысы реакция басқа нүктеде тоқтаған.
• Эксперименталды түрде төрт тест дайындалады. Әрқайсысында қызығушылық тудыратын биологиялық сынамадан алынған ДНҚ, қалыпты нуклеотидтер және төрт арнайы нуклеотид типтерінің бірі бар. Кез-келген арнайы нуклеотидтер флуоресцентті маркердің қандай-да бір түрімен белгіленеді (төмендегі автоматтандырылған тізбекті қараңыз).

Бірінші қадам - ​​синтезделген тізбектердің әрқайсысын олардың көлеміне қарай бөлу. Кейбіреулер басқаларға қарағанда ұзағырақ болады, бұл арнайы базалардың енгізілген жеріне байланысты.

Дискриминациялық қасиет ретінде мөлшерді қолданып қоспаның компоненттерін бөлуге мүмкіндік беретін әр түрлі биохимиялық әдістер бар. Сангер әдісінде әр түрлі тізбектер электрофорез арқылы бөлінеді. Техниканың неғұрлым күрделі нұсқаларында капиллярлық электрофорез қолданылады.

Осылайша, ұзын жіптер қысқа нұсқаларға қарағанда аз жүреді. Содан кейін бұл жүйе әрбір видеоксинуклеотидке енгізілген маркерді танитын оқырманнан өтеді. Осылайша реттіліктің ретін білуге ​​болады.

Бұл «бірінші ұрпақ» техникасы 1 килобазадан аспайтын ДНҚ фрагменттерін оқи алады. Қазіргі уақытта Сангер әдісі әртүрлі зертханаларда, әдетте оның қазіргі нұсқаларында қолданылады. Сонымен қатар, ол алынған нәтижелерді ең күрделі техникамен растау үшін қолданылады - бірақ онша дәл емес.