Факторы распространения вирусных болезней картофеля

УДК: 619:616, 076

Казахский агротехнический университет имени С. Сейфуллина

ЗКФ ТОО Казахский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства

Начальник Северо-Западного регионального управления МСХ РК

ГУ «Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики

и методологии в ветеринарии» МСХ РК
Мақалада түйелердің қоздырушысын – Trichophyton sarkisovii дерматомицетінен толық полисахаридті және белокты антигеңдердің сипаттамасы және бөліп алу жұмысы жазылған. Антигендер Westphal-Jann (1965), Табатабай (1979), Буавену-Месробеану және аутогедролиз әдстерімен әзірленген. Алынған антигендер ИФТ – жанама әдісінде жоғары белсенділігімен және прециптирлеуші қасиетімен сипатталады.
В статье раскрывается ход работы по получению и характеристике полных, полисахаридных и белковых антигенов из дерматомицета T. sarkisovii – возбудителя трихофитии верблюдов. Выделены антигены по методу Westphal-Jann (1965), по методу Табатабай (1979), по Буавену-Месробеану и аутогидролизом. Полученные антигены отличаются наличием преципитирующих свойств и достаточной активностью в непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА).
The work process on reception and characteristic of full, polisaharids and albuminous antigenes from dermatomicet T. sarkisovii – the activator of Trichophyton at camels is revealed in the article. Antigenes according to Westphal-Jann’s method (1965), Tabatabaj’s method (1979), Buavenu-Mesrobeanu and autogedrolis are allocated. The received antigenes differ in presence of precipiti properties and sufficient activity in indirect variant of IFA.
Трихофития верблюдов – инфекционное заболевание, наносящее огромный экономический ущерб развитию этой отрасли животноводства в Республике Казахстан. В верблюдоводстве дерматофития наносит весомый ущерб, вызывая истощение и смертельные исходы больных верблюжат. Верблюды с клиникой трихофитии отстают в росте и развитии, снижают производство молока, мяса и привес, ухудшается качество выделываемых шкур, нарушается племенная работа и планы продажи верблюдов, ценная верблюжья шерсть утилизируется [1].

Согласно эпизоотическим данным, в отдельных областях, таких как Западно-Казахстанская, Мангистауская, Актюбинская областях заболеваемость составляет от 20 до 36 % с преобладанием в этиологической структуре возбудителя трихофитии T. sarkisovii. Клиническая диагностика и борьба с заболеванием затруднены вследствие густого шерстного покрова у животных, особенностей содержания, отсутствием лечебно-профилактических препаратов [2]. Соответственно, весьма актуальной остается проблема своевременного выявления трихофитии верблюдов, что требует наличия активных и специфичных компонентов для постановки серологических реакций, в том числе антигенных препаратов.

Антигены различной химической природы получали: полисахаридные – по методу Westphal и Jann (1965) [4]; белковые – по методу Табатабай (1979) в нашей модификации [5]; полные – по Буавену-Месробеану [6]; полисахариды – аутогидролизом [7].

Определение концентрации белка проводили по методу Бредфорда и концентрации углеводов – серно-фенольным методом по Молишу [8, 9].

Результаты исследований. Полученная ранее [3] в результате глубинного культивирования и инактивированная автоклавированием биомасса дерматомицетов отделялась от жидкой питательной среды фильтрованием через бумажный фильтр и трижды отмывалась физиологическим раствором с целью максимального освобождения от культуральной жидкости. Сырой мицелий взвешивался для определения выхода биомассы со 100 мл питательной среды. Выход биомассы гриба T. sarkisovii с каждых 100 мл среды при глубинном культивировании в колбах на 250 мл составил в каждом конкретном случае: 10,0 г; 14,0 г; 15,8 г; 12,0 г; 13,8 г; а с каждых 200 мл при культивировании в колбах на 500 мл – 22,4 и 47,8 г. Анализ выхода биомассы с колб на 250 мл показал, что в среднем на каждые 100 мл питательной среды можно получить 13,12 ± 1,7 г.

Всего было получено 135,8 г сырого мицелия. В среднем выход мицелиальной массы составляет 15,1 ± 4,07 г со 100 мл питательной среды. Более высокие средние показатели выхода урожая биомассы гриба в целом связаны с высоким выходом мицелия при культивировании в колбах бóльшего объема (на 500 мл), который составил от 22,4 до 47,9 г.

На следующем этапе из отмытой биомассы гриба получали антигены по методам L.Tabatabai (1979) и Westphal О. и Jann К. (1965), Буавену-Месробеану. Очищенные полисахариды получали из полисахаридного антигена по Westphal О. и Jann К. (1965) аутогидролизом.

Получали полисахаридные антигены по методу Westphal и Jann: отфильтрованную грибную массу тщательно суспендировали в дистиллированной воде при t˚ + 65-68 °С, выдерживали при температуре + 68 °С в течение 30 минут, затем добавляли 90 % фенол до 45 % концентрации. Снова выдерживали смесь в течение 30 минут, периодически встряхивая, и охлаждали до + 4 °С. Охлажденную смесь центрифугировали при 3500 оборотах 15 мин, отбирали верхний слой (без промежуточной фазы), т.к. полисахарид переходит в жидкую водную фазу. Добавляли два объ­ёма этанола (95°), охлажденного до минус 20 °С и тщательно перемешивали.

При добавлении этанола к водной фазе отмечали переход полисахарида их растворимого состояния в коллоидное, что проявлялось в виде появления гелеобразного сгустка (рисунок 1), который в дальнейшем исчезал при тщательном перемешивании водной и спиртовой фазы.

Затем смесь выдерживали 16-18 часов при минус 60 °С, после чего осаждали полисахарид центрифугированием при 3500 оборотов в течение 25 минут. Этанол сливали, осадок подсушивали в 1 мл дистиллированной воды. Нерастворимые частицы осаждали с помощью низкоскоростного центрифугирования 2000 оборотов в течение 10 минут.

На рисунке показано образование геля полисахарида при добавлении двойного объема 96º спирта в водную фазу супернатанта Рисунок 1 – Получение антигена по методу Westphal-Jann (1965)

При получении полных антигенов по методу Буавену-Месробеану клетки грибов, выращенных на жидких питательных средах, отмывали от среды физиологическим раствором при трехкратном взбалтывании и отстаивании, подсушивали в термостате до получения сухой массы колоний. Одну часть грибной массы заливали 20 частями 0,5 % раствора ТХУ. Смесь выдерживали в течение 18 часов при 4 С, периодически встряхивая, затем центрифугировали. Надосадочную жидкость собирали, нейтрализовали 0,25 %-ным раствором NaOH до рН 7,2. К этой жидкости прибавляли 4×кратный объём этилового спирта и выдерживали до выпадения хлопьев полисахарида. Антиген осаждали центрифугированием при 3000 оборотов в течение 30 минут. Осадок ресуспендировали в 1 см³ дистиллированной воды.

Выделение растворимых белков клеточной стенки по методу L Tabatabai (1975) проводили экстракцией цитратным буфером биомассы гриба T. sarkisovii после обработки 45 % фенолом, которая проводилась ранее в целях выделения полисахаридов методом Westphal-Jann (рисунок 2). Биомассу предварительно трижды отмывали от фенола в дистиллированной воде. Белки экстрагировали при непрерывном перемешивании и дальнейшем центрифугировании через сутки. Полученный супернатант центрифугировали повторно 20 мин при 3000 об/мин.

Очищали антигены методами диализа, низкоскоростного центрифугирования, гель-фильтрационной хроматографии на сефадексе G-75.

Низкоскоростное центрифугирование, для удаления осадка разрушенных клеток и примесей, во всех случаях проводили при 2000 об./мин в течение 30 минут. Диализ проводили в течение 24 часов в дистиллированной воде при температуре 4 °С с целью удаления из растворов антигенов трихлоруксусной кислоты, фенола и других реактивов, использованных при их получении, а также иных низкомолекулярных веществ.

Рисунок 2 – Биомасса дерматомицета T. sarkisovii после выделения поверхностных полисахаридов 45 % фенолом

При хроматографической очистке белкового и полисахаридных антигенов дерматомицета компоненты антигенных растворов разделялись на две фракции, причем выход первой фракции регистрировался сразу за свободным объёмом колонки, а выход второй фракции – через два свободных объема сразу после выхода первой фракции.

Стандартизировали антигены по содержанию основного вещества (белковые антигены – по белку, полисахаридные – по концентрации углеводов). Концентрацию белков определяли по методу Бредфорда, углеводов – по Молишу. Учет результатов проводили визуально (таблица 1).

Следует отметить, что монокомпонентный антиген получен только в одном случае – при дальнейшей обработке полисахаридов клеточной стенки T. sarkisovii, выделенных методом Вестфаль-Яна, аутогидролизом, во время которого, по-видимому, происходит полная денатурация белка и переход его в нерастворимое состояние.

Как видно из таблицы 1, наибольшая концентрация углеводов содержится в полисахаридных антигенах, полученных по методу Вестфаль-Яна, наибольшая концентрация белка – в белковых антигенах, полученных по методу Табатабай. Концентрация белков и углеводов в достаточной мере характеризует полученные антигены как полисахаридный (метод Вестфаль-Яна) и белковый (метод Табатабай).

Полученные антигены исследовали в реакции иммунодиффузии (РИД) с сыворотками крови верблюдов, полученных от здоровых верблюжат и от верблюдов с клиническими признаками трихофитии, доставленными из различных хозяйств Западно-Казахстанской области. Сыворотки крови верблюдов предварительно протестированы в реакции агглютинации (РА) на наличие титров специфических антител. По результатам РА отобраны явно отрицательная и явно положительная сыворотки, которые были использованы в качестве положительного и отрицательного контроля в дальнейшей работе.

Постановку РИД осуществляли по O. Оuchterlony (1958) на 1 % агаре. Учет результатов реакции проводили через 24-48-72 часа.

По результатам РИД установлено наличие преципитирующих свойств у полисахаридных антигенов, полученных по методу Westphal-Jann и по Буавену-Месробеану, что регистрировалось в виде явно выраженной линии преципитации между антигеном и положительной сывороткой (рисунок 3). У белкового антигена дерматомицета наличие преципитирующих свойств в реакции преципитации (РП) выражены слабее, линия преципитации еле заметна. Следует отметить, что линия преципитации у неочищенных антигенов выражена слабее, чем у антигенов, очищенных методом диализа. Считаем, что отсутствие активности в РИД у белкового антигена можно объяснить низким содержанием полисахарида, обеспечивающим антигенность полученных компонентов клеточной стенки грибов, т.к. именно они являются антигенными детерминантами у дерматомицетов, хотя согласно литературным данным, белки микроорганизмов обладают более выраженными антигенными и иммуногенными свойствами.

А Б Рисунок 3 – Результаты тестирования полисахаридного антигена по Westphal-Jann (А) и полного антигена по Буавену-Месробеану (Б) в РИД с сыворотками крови верблюдов

В дальнейшей работе проводили изучение активности белкового и полисахаридного антигенов, полученных по методу L. Tabatabai (1975) и по методу Westphal-Jann, в непрямом варианте ИФА.

Полученными антигенами иммунизировали мышей по методу Фридляндской И. И. Для этого были подобраны по методу пар-аналогов 4 белые мышки, иммунизированные по следующей схеме: в 1 день 100 мкл антигена + 100 мкл полного адъюванта Фрейнда, на 7 день 100 мкл антигена + 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда, на 11, 12, 13 дни вводили по 100 мкл антигена + 100 мкл физиологического раствора. На 17 сутки иммунизации отбирали сыворотки крови у иммунизированных мышей. Контроль активности выработанного иммунного ответа проверяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа.

Средний титр антител в крови мышей иммунизированных белковым антигеном составил 1:1400 ± 0,38, средний титр антител в крови мышей, иммунизированных полисахаридным антигеном Westphal-Jann, составил 1:3200 ± 0,5.

Анализ результатов тестирования активности и специфичности полисахаридного антигена против сывороток крови белых мышей, иммунизированных полисахаридным антигеном по Westphal О., Jann K., показал, что полисахаридные антигены грибов T. sarkisovii обладают достаточной активностью, но слабой специфичностью, вступая в перекрестную реакцию с родственными антителами, хотя и в невысоких титрах (до 1:400). Полученные результаты можно объяснить особенностями строения клеточной стенки грибов, состоящей в основном из полисахаридов, которые входят в состав клеточных стенок представителей различных видов, родов и даже семейств микромицетов.

Белки дерматомицета имеют меньшую активность в ИФА, а их специфичность аналогична полисахаридным антигенам, что также вполне объяснимо, т.к. они связаны с полисахаридами и входят в состав комплексов полисахарид-белок в виде пептидогликанов, галактоманнана и т.д.

Таким образом, в результате исследований нами отработана методика получения антигенов различной химической природы из дерматомицетa T. sarkisovii, определена концентрация белка и углеводов в полученных антигенах, выявлена достаточная антигенная активность и специфичность белковых и полисахаридных препаратов дерматофита – возбудителя трихофитии верблюдов, что позволяет надеяться на возможность их использования в качестве антигенов-диагностикума в иммуноферментном анализе и других серологических реакциях.

ЛИТЕРАТУРА
1. Саркисов, А. Х. Победа над трихофитией / А. Х. Саркисов. – В кн.: Наука и человечество, 1984: Доступно и точно о главном в мировой науке. Междунар. ежегодник – М.: Знание. – 1984. – С. 142-152.

2. Толеутаева, С. Т. Трихофития животных и методы борьбы с ней в Республике Казахстан / С. Т. Толеутаева: автореф. … докт. вет. наук. 16.00.03. – Алматы: КазНИВИ. – 2008. – 48 с.

3. Пак, М. Е. Технологические параметры получения биомассы дерматомицетов для изготовления антигенов-диагностикумов при трихофитии верблюдов / М. Е. Пак, Ш. Ж. Турсункулов // Вестник науки КазАТУ им. С. Сейфуллина. – Спец. выпуск (мат. межд. конф.) – Астана. – 2008. – С. 282-291.

4. Кухар, Е. А. Получение клеточно-ассоциированного поверхностного липополисахаридного антигена гриба Trichophyton sarkisovii – возбудителя трихофитии верблюдов / Е. А. Кухар, К. К. Муканов, Б. К. Сейткасымов // Мат. научно-практ. конф. АкмолГМА. – Астана. – 1998. – С. 189-193.

5. Сұраншиев, Ж.Ә. Brucella-ның сыртқы мембрана белоктарын сиыр бруцеллезін балауда қолдану / Ж. Ә. Сұраншиев. – Вет. ғыл. кан. ... диссертациясы. – Астана қ. –2003 ж. – Б. 115.

6. Курасова, В. В. Методы исследования в ветеринарной микологии / В. В. Курасова, В. В. Костин, Л. С. Малиновская. – М.: Колос. – 1971. – с. 312.

7. Командрова, Н. А. Строение О-специфической полисахаридной цепи липополисахарида Yersinia pseudotuberculosis серовара VII. / Н. А. Командрова, Р. П. Горшкова, В. А. Зубков и др. // Биоорг. химия. – Т. 15. – 1989. – № 1. – С. 104-110.

8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive mehtod for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-due binding / M. M. Bradford. // Anal. Biochem. – 1976. – V. 72. – P. 248-254.

9. Методы общей бактериологии. / Под ред. Ф. Герхардта. – Т. 2. – Москва. : Мир. – 1984. – С. 221-334.
УДК 619:616:982.2
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ТУБЕРКУЛИНОВЫХ РЕАКЦИЙ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
В. А. Сапа, В. И. Пионтковский

Костанайский государственный университет имени А. Байтурсынова

Проявление неспецифических туберкулиновых реакций имеет полиэтиологический характер и зависит от многочисленных факторов: сенсибилизации организма животных атипичными микобактериями, микобактериями птичьего и человеческого видов, паратуберкулёзного энтерита, от сопутствующих других инфекционных болезней (лейкоз, некробактериоз), от заболеваний травматического характера (ретикулит, ретикулоперикардит) от гнойных процессов, от гельминтозных поражений, грибковых заболеваний, а также от многих стрессовых факторов.

В обширной научной литературе по проблеме неспецифической реактивности к туберкулину исследователи раскрывают многие вопросы этого явления, но не дают ответа, как устранить её [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Появились работы о применении в животноводстве и ветеринарии природных цеолитовых туфов вулканического происхождения, оказывающих детоксическое влияние на организм животного и во многом устраняющих неспецифическую реактивность к ППД-туберкулину для млекопитающих [7]. Для устранения неспецифической реактивности на туберкулин у крупного рогатого скота мы апробировали новый системный подход к проведению ветеринарно-профилактических мероприятий, позволяющий сократить число проявлений неспецифических туберкулиновых реакций, уменьшить выбраковку и убой продуктивных животных [8, 9, 10].

Дифференциацию проявившихся туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота сельхозформирований проводили по четко определённой схеме. Суть её состоит в том, что крупный рогатый скот с 2-х месячного возраста подвергали периодическим клиническим и аллергическим исследованиям, при выделениях реагирующих – контрольно-диагностическому убою и тщательной ветеринарно-санитарной экспертизе туш убитых животных, а также лабораторным исследованиям биоматериала для исключения или подтверждения туберкулёза и установления вида микобактерий. При необходимости проводили переисследования реагирующих стандартной и половинной дозами ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД-туберкулина для птиц, L-туберкулином для исключения скрытых форм туберкулёза, исследование сыворотки крови методами иммуноферментного анализа (ИФА) и ПЦР. Кроме того, государственная ветеринарная служба сельских округов, районов и городов строго контролировала весь объём противотуберкулёзных мероприятий, в том числе и отслеживала послеубойные результаты на мясоперерабатывающих предприятиях и убойных пунктах сельхозформирований.

Сводные данные по дифференциации проявившихся аллергических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота пяти сельхозформирований (ТОО «Викторовское», «Караман-К», «Азия-Алтын 2000», АО «Заря» и «Север») представлены в таблице.

Из анализа показателей таблицы следует, что из подвергнутых аллергическим исследованиям крупного рогатого скота (более 49,0 тысяч исследований) за 2004-2008 годы выделено 300 голов реагирующих в диагностических тестах (0,61 % с колебанием от 0,41 до 1,56).

При дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, прореагировавших на стандартную дозу аллергена на 3-5 мм и более, 112 животных подвергли контрольно-диагностическому убою. Туши, внутренние органы и лимфоузлы тщательно осматривали, биоматериал от них исследовали лабораторными методами – микроскопия, выделение чистой культуры микобактерий и биопроба на кроликах и морских свинках. Кроме того, при отрицательных результатах патологоанатомических исследований, оставшихся реагирующих животных через месяц переисследовали стандартной и половинной дозами ППД-туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц, L-туберкулином для диагностики скрытых форм туберкулёза, а сыворотки крови – дополнительно исследовали методом ИФА и ПЦР.

Во всех случаях, туберкулёз у исследуемых животных исключён комплексом примененных методов – эпизоотологических, клинических, патологоанатомических, лабораторных, включая бактериологические и биопробу на кроликах и морских свинках, а также методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакцией.