59(H2N2) 03. 02. 02 вирусология

жүктеу/скачать 0.54 Mb.

бет	2/4
Дата	01.07.2016
өлшемі	0.54 Mb.
	#169429
түрі	Автореферат

1 2 3 4

Изучение реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и вирулентным штаммом А/WSN/33(H1N1), полученных методом обратной генетики.

Таблица 4. Анализ антигенной специфичности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02(H3N2)

Исходные штаммы и реассортанты	Титр сывороточных антител в РЗГА при взаимодействии вирусов с антисыворотками
Исходные штаммы и реассортанты	Анти-H3N2	Анти-H2N2
A/Кумамото/102/02(H3N2)	1:640	<1:10
А/Краснодар/101/35/59(H2N2)	<1:10	1:320
A/Кумамото/R1	1:640	<1:10
A/Кумамото/R2	1:640	<1:10
A/Кумамото/R3	1:640	<1:10

Таблица 5. Анализ антигенной специфичности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и вирулентного штамма А/Берн/07/95(H1N1)

Исходные штаммы и реассортанты	Титр сывороточных антител в РЗГА при взаимодействии вирусов с антисыворотками
Исходные штаммы и реассортанты	Анти-H1N1	Анти-H2N2
A/Берн/7/95(H1N1)	1:320	<1:10
А/Краснодар/101/35/59(H2N2)	<1:10	1:320
A/Берн/R1	1:160	<1:10
A/Берн/R2	1:320	<1:10

Представляло интерес исследовать также иммуногенную активность полученных реассортантов при интраназальном введении вирусного материала мышам. В таблице 6 представлены данные по изучению иммуногенности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02(H3N2). Как видно из таблицы, титр антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных интраназально реассортантами A/Кумамото/R1, A/Кумамото/R2, A/Кумамото/R3 в дозе 6,5 lg после двукратной иммунизации равнялся соответственно 1:80-1:160, 1:160 и 1:80. В таблице 7 представлены данные по изучению иммуногенности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и вирулентного штамма А/Берн/07/95(H1N1). Как видно из данной таблицы, титр антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных диким штаммом А/Берн/07/95(H1N1), равнялся 1:320. Титры антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных реассортантами A/Берн/R1 и A/Берн/R2, равнялись соответственно 1:80- 1:160 и 1:320. Полученные факты свидетельствуют о сравнительно высокой иммуногенности полученных ts- реассортантов на базе штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2).

Таблица 6. Иммуногенная активность реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02(H3N2).

Сыворотка	Антигены
Сыворотка	А/Кумамото/102/02	A/Кумамото/R1	A/Кумамото/R2	A/Кумамото/R3
A/Кумамото/102/02	320	320	160	160
A/Кумамото/R1	320	80-160	-	-
A/Кумамото/R2	320	-	160	-
A/Кумамото/R3	160	-	-	80
Неимунная	<10	<10	<10	<10

Таблица 7. Иммуногенная активность реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентного штамма А/Берн/07/95(H1N1).

Сыворотка	Антигены
Сыворотка	А/Берн/07/95	A/Берн/R1	A/Берн/R2
A/Берн/07/95	160	320	320
A/Берн/R1	160	80	-
A/Берн/R2	320	-	320
Неимунная	<10	<10	<10

Далее был проведен анализ генома реассортантов, полученных методами «классической» реассортации. Из множества доступных методов был выбран метод секвенирования. Предварительно мы провели подбор эффективных праймеров для каждого РНК-сегмента генома реассортантов, что позволило оптимизировать работу. Результаты анализа генома реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02(H3N2) представлены в таблице 8.

Таблица 8. Результаты анализа генома реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02(Н3N2).

Ген Реассортант	HA	NA	PB1	PB2	PA	NP	M	NS
A/Кумамото/R1	ДТ	ДТ	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА
A/Кумамото/R2	ДТ	ДТ	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА
A/Кумамото/R3	ДТ	ДТ	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА

Как видно, все исследованные реассортанты имели 6 генов, кодирующих «внутренние» белки от ХА штамма, и 2 гена, кодирующих поверхностные белки-гликопротеиды от вирулентного штамма А/Кумамото/102/02(H3N2). Следующая таблица показывает результаты анализа генома реассортантов полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентного штамма А/Берн/07/95(H1N1). Как видно из таблицы 9, данные реассортанты также унаследовали 6 генов, кодирующих «внутренние» белки от ХА штамма, и 2 гена, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу, от вирулентного штамма А/Берн/07/95.

Таблица 9. Результаты анализа генома реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентного штамма А/Берн/07/95(H1N1).

Ген Реассортант	HA	NA	PB1	PB2	PA	NP	M	NS
A/Берн/R1	ДТ	ДТ	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА
A/Берн/R2	ДТ	ДТ	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА	ХА

Полученные данные свидетельствуют о том, что полученные реассортанты, во-первых, имеют наиболее оптимальное сочетание генов, и, во-вторых, имеют гены, кодирующие нейраминидазу, от вирулентных штаммов.

В опытах на мышах нами также была исследована защитная эффективность ХА реассортантов А/Берн/R1 и А/Берн/R2. Мышей вакцинировали дважды интраназально ХА реассортантами в дозе 6 lg ЭИД₅₀/0,05 мл с последующим инфицированием различными дозами вирулентного родительского штамма А/Берн/07/95(H1N1) и дрейфовых вариантов А/Чили/01/83(H1N1) и А/Москва/904/77(H1N1). Титры вируса в легких при заражении невакцинированных мышей составляли: для штамма А/Берн/07/95 – 3,5 lg ЭИД50/0,2 мл, для штамма А/Чили/01/83(H1N1) – 2 lg ЭИД₅₀/0,2 мл и для штамма А/Москва/904/77(H1N1) – 1 lg ЭИД50/0,2 мл. У вакцинированных мышей в легких не наблюдалось вирусного размножения как при заражении родительским штаммом А/Берн/07/95(H1N1), так и при заражении дрейфовыми вариантами. Этот факт свидетельствует о том, что ХА реассортанты, полученные нами, обеспечивают защиту не только против родительского вируса, но и против дрейфовых вариантов вируса гриппа.

Таблица 10. Защитная эффективность ХА реассортнатов, полученных при скрещивании между ХА А/Краснодар/101/59(H2N2) и вирулентным штаммом А/Берн/07/95(H1N1)

Дикий штамм вируса гриппа А	Титр дикого вируса в легких мышей lg ЭИД₅₀/0,2 мл
	Контроль, невакцинированные мыши	Мыши, вакцинированные ХА реассортантами
	Контроль, невакцинированные мыши	А/Берн/R1	А/Берн/R2
А/Берн/07/95	3,5	0	0
А/Чили/01/83	2,0	0	0
А/Москва/904/77	1,0	0	0

• Приведены данные одного из 3-х опытов.

Изучение реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и вирулентным штаммом А/WSN/33(H1N1), полученных методом обратной генетики.

На первой стадии работы был исследован ts и са фенотип одногенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59 и штаммом А/WSN/33 (табл. 11). Было показано, что исходный эпидемический штамм A/WSN/33(H1N1) обладал одинаковой репродуктивной способностью при 34°С и 38°С и не размножался при 25°С.

Таблица 11. Изучение ts и са фенотипа одногенных реассортантов между штаммами вируса гриппа A/WSN/33(H1N1) и ХА А/Краснодар/101/35/59(H2N2)

Исходные вирусы и реассортанты

Генотип реассортанта

Титр вируса

lg ЭИД₅₀/0,2 мл

Фенотип

34°С

38°С

25°С

A/WSN/33

PB2

PB1

6,5±0,5

6,25±0,4

1,0

А/Краснодар/101/35/59

PB2

PB1

6,25±0,5

< 1,0

5,5±1,0

ts, ca

PB2

PB1

5,0±0,5

4,5±0,5

<1.0

PB2

PB1

6,5±0,32

1,5±0,4

PB2

PB1

6,25±0,25

6,5±0,28

1,5±0,4

PB2

PB1

5,75±0,74

6,0±0,86

<1,0

PB2

PB1

4,75±0,25

3,75±0,2

<1,0

PB2

PB1

6,5±0,4

< 1,0

1,5±0,57

РНК- сегменты генома А/WSN/33 - выделены черным шрифтом

РНК – сегменты генома А/Краснодар/101/35/101 – выделены красной заливкой
С другой стороны ХА вакцинный штамм хорошо размножался в куриных эмбрионах при 34°С и не размножался при повышенной температуре (38°С). Однако, включение генов ХА штамма в геном вирулентного штамма A/WSN/33(H1N1) сопровождалось различными эффектами. В частности, добавление единичных РНК-сегментов из генома штамма А/Краснодар/101/35/59, кодирующих белки PB1 и NS1/NS2 в геном вирулентного штамма приводило к появлению реассортантов, неспособных к размножению при 38°С, либо обладающих слабым размножением в этих условиях. Включение единичных РНК-сегментов, кодирующих белки ХА штамма PB2, PA и NP приводило к появлению реассортантов, не отличающихся по ts и са фенотипу от вирулентного штамма A/WSN/33. А РНК-сегмент, кодирующий белки ХА штамма М1/М2, включенный в геном вирулентного штамма, давал полученным реассортантам промежуточную степень размножения при 38^° С.

Включение большего количества РНК-сегментов генома ХА штамма в геном вирулентного штамма A/WSN/33 приводило к появлению большего числа реассортантов, обладающих ts фенотипом, а также большей выраженностью этого фенотипа. Дополнительное включение PB1-гена от ХА штамма в состав реассортантов имело следствием формирование у этих реассортантов выраженного ts фенотипа. К аналогичному эффекту приводило дополнительное включение NS-гена от ХА штамма в геном полигенных реассортантов (Табл. 12).

Таблица 12. Изучение ts и са фенотипа полигенных реассортантов между штаммами вируса гриппа А/WSN/33 (H1N1) и ХА А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2)

Исходные вирусы и реассортанты

Генотип реассортанта

Титр вируса

lg ЭИД₅₀/0,2 мл

Фенотип

34°С

38°С

25°С

A/WSN/33

PB2

PB1

6,5±0,5

6,5±0,4

<1,0

А/Краснодар/101

/35/59

PB2

PB1

6,0±0,5

<1,0

5,5±1,0

PB2

PB1

6,5±0,24

<1,0

2,5±1,0

PB2

PB1

6,0±0,56

4,25±1,0

<1,0

PB2

PB1

6,0±0,5

1,0

1,5±0,4

PB2

PB1

5,5±0,75

<1,0

PB2

PB1

5,0±1,0

3,75±0,75

<1,0

PB2

PB1

5,5±0,78

<1,0

PB2

PB1

5,5±0,75

<1,0

PB2

PB1

5,25±0,2

<1,0

1,5±0,4

PB2

PB1

5,5±0,75

<1,0

При изучении са фенотипа реассортантов, т.е. способности размножаться при 25°С, было установлено, что вирулентный штамм A/WSN/33 практически не размножался при 25°С, в то время как ХА штамм активно размножался при данной температуре до титров 5,5-6,0 lg. Все полученные одногенные реассортанты характеризовались слабым размножением при 25°С, не превышая титров 10^1.0- 10^1.5ЭИД₅₀/0.2мл. Из полученных данных можно предположить, что для активного размножения ХА штамма при 25°С необходима функциональная активность большей части, если не всей совокупности, мутантных белков ХА штамма.

На следующем этапе нашей работы мы попытались исследовать вирулентность наших одногенных реассортантов для мышей (Табл. 13). Аттенуация реассортантов оценивалась по их способности реплицироваться в легочной ткани мышей после интраназальной инокуляции. Инфицирование вирулентным штаммом приводило к размножению вируса в назальном эпителии мышей и в легких, в то время как репликация вакцинного штамма наблюдалась только в верхних дыхательных путях.

жүктеу/скачать 0.54 Mb.

Достарыңызбен бөлісу:

1 2 3 4