Iiksh 4344– «індеттану және індетке қарсы шаралар» (ПОӘК)
жүктеу/скачать 4.84 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Тақырыбы
- Құралдар және материалдар
| Бақылау сұрақтар:
1. Серологиялық реакция дегеніміз не? 2. АР компаненттері және қою тәртібі? 3. АР нәтижесін бағалау реті? № 3-сабақ Тақырыбы: Жұқпалы ауруларды серологиялық балау әдістері (ИФТ) Сабақтың мақсаты: Жұқпалы ауруларды қосымша факторлы серологиялық реакциялармен таныстыру Құралдар және материалдар: Бруцеллезді ИФТ арқылы балауға арналған жинақ; дозатор; зерттелетін қан сарысуы; термостат. Сабақтың мазмұны: Иммуноферменттік талдау (ИФТ) әдісін Е.Энгвалл мен П.Переман (1972) ұсынған. Оның негізінде фермент пен антидененің молекулалары қосылғаннан кейін де олар функцияларын сақтайды, яғни антидене антигенмен әрекеттеседі, ал фермент субстратты ыдыратады. Бұл әдістің негізгі классикалық вариантында антиген тығыз ортаға орналастырылады гетерогенді әдіс, немесе тығыз фазалы ИФT, ағылшынша enzyme-linked immunosorbent assау (ELISA) деп аталады. Бұл реакцияны қойғанда антиген антидене-фермент коньюгатымен байланысқан соң субстрат қосылады. Реакцияның қойылу реті ИФT әдетте полистрол планшеттің ұяшықтарының немсе мембраналық фильтрдің беткейінде қойылады. Гетерогенді (тығыз фазалы) вариантынан басқа гомогенді ИФТ бар, ағылшынша — enzyme-multiplied immunotest (ЕМІТ). Бұл вариантта фермент пен антигеннің коньюгаты қолданылады. Бұл коньюгаттағы антиген антиденемен қосылған соң фермент белсенділігін жоғалтады. ELISA кең ауқымды қолданылады да ИФT атауының балама синонимы ретінде қабылданады. ИФT тура және кері варианттарында қолданылады. Тура вариантында нақты антигенге қарсы антидене таңбаланады. Кері вариантында антиденелер таңбаланбайды жануардың әр түрінің глобулиніне қарсы антиглобулин коньюгаты пайдаланылады. ИФТ-ның сэндвич варианты. Ағылшынша — Sandwіch — «қыстырылған», «екеудің арасында» мағынасында. Алдымен беткейге таңбаланған антидене орналастырылып, оған антигені бар субстрат, содан кейін антигенге қарсы таңбаланған антидене коньюгаты қосылады. Осылайша анықталатын антиген таңбаланбаған және таңбаланған екі антидененің арасында қалады. Бұл реакцияны антиденені анықтау үшін де қоюға болады. Ондай жағдайда антидене екі антигеннің арасында қалады. Антигенді таңбаланбаған күйінде алып, оған таңбаланған антиглобулин коньюгатымен әсет етеді.ИФТ-ның конкуренттi варианты. Беткейге таңбаланбаған антиген немесе антидене бекітіліп, оның үстіне тиісінше айқындалатын антиген немесе антидене қосылады. Содан кейін беткейдегі антиген немесе антиденеге қарсы таңбаланған антидене немесе антиген коньюгаты қосылады. Нәтижесі тура вариантына қарама қарсы бағаланады. Иммуноферменттік талдаудың кері вариантын қою тәсілі 1. Иммуноферменттік талдаудың кері әдісін ауруды анықтауға немесе зерттеудің сапасын растауға қолданады. Бірақ реакцияның сезгіштік және ерекшелігі иммуноглобулин коньюгаттың ерекшелігіне байланысты, сонымен қатар сынаулардың таңдалған сұйылту коэффицентеріне көңіл бөледі. Коньюгатты кең ерекшелігі бар және әлсіз сарысу сұйылтуда реакцияның сезгіштігі жоғарылайды. Тар ерекшелікті коньюгат (мысалы қарсы-IgGI) және сынама сұйылту дәрежесі көбірек болғанда реакцияның балау ерекшелігі жоғарылайды. 2. Тесті 96 шұңқырлы түбі жайпақ полистирендік планшеттерде жүзеге асырады. Планшеттерді сапалы таңдауы, тестерде бір – түсті бөгеттер қоршауға көмектеседі. Протеиндердің бекітуі әлсіз немесе орта болғанда, планшеттер антигеннің бекітуіне ең төмен белсенділігін көрсетеді. 3. Антиген буферлі ерітіндісі 0,05 м карбонаттық – бикарбонат буферлі ерітінді рН 9,6 құрылысы NaHCO3 (2,93 г), Na2CO3 (1,50 г) және NaN3 (0,2 г) 1 литр тазартылған су. Коньюгатпен зерттейтін еріткіш буферлі ерітінді құрамы – 0,01 М ФБР рН 7,2 +0,05 % твин 20 N2HPO4 (1,21г), KH2 PO4 (0,02 г) NaCl (8,00 г) KCl (0,20 г) 1 литр таза су + 0,50 мл твин/ литр. Планшеттерді жууға буферлі ерітінді 0,003 М ФБР рН 704 + 0,05 % Твин – 20 ны қолданады. 4. Коньюгат ретінде көп клонды антиген қолданылады - IgGl ауыр және жеңіл тізбекті ерекше сарысумен пероксидаз желкек қоспасы қосылған. Субстрат ұсынатын қоспа 4,4 mM H2 O2 және 3,6 mM 2.2 – amino – bis – (3 – этилбензотиозамин – 6-сульфоновокислы) (ABTS) 0,05 М фосфат – цитрат буферлі ерітінді, рН 4,5 , құрылушыда 0,2 M Na2 HPO2 (25.7 мл) 0,1 М лимон қышқылы (24,3 мл) және тазартылған су (50 мл) (қажетті кезде рН-ын тексеру керек). Реакцияны тежеу ерітіндісі 4 % додекасульфат натрий немесе 0,1 М Na N3 тазартылған суға дайындалады. 5. Тәжірибені жүргізу. Антигенді бекіту буферлі ерітінді концентрацияда сұйылтады, титрі шахмат ретінде анықталған (1 мг/мл шамалы). Барлық шұңқырларға 100 мкл көлемінде құйылады. Содан соң аз көлемде планшеттарды 2 сағатқа 370 С немесе 40 С бір түнге қояды.ELISA қатты фаза қорытындысы: әр этап араларында шұңқырларды тазартып жуу қажет, байланыспаған компоненттерді кетіруүшін. Буферлі ерітінді көмегімен 3-4 рет жуу жеткілікті деп есептеледі. Жаңа реагент қосылуының алдында планшеттер төңкеріп, соратын беттерге кептіріледі, барлық сұйықтық қалдықты жоюүшін. Зерттейтін және бақылау сары суын 1/200–ге буферлі ерітіндіге сұйылтады, барлық шұңқырларға 100 мкл нен құяды. Планшеттерді жауып, айналу бұлғауышы бар термостатқа 370 С бір сағатқа қояды. Планшеттерді жуады 3 – 4 рет. 6. Энзиматикалық коньюгатті буферлі ерітіндіге сұйылтады 100 мкл–нен барлық шұңқырларға қосады. Планшетті жауып айналмалы бұлғауышы бар термостатқа 370 С бір сағатқа салады толассыз сілкіндірумен. 7. Субстрат ерітінді қоспасы қолдану алдында әзірленеді, 60 мкл 3 % H2 O2 негізгі ерітіндіге 12 мл буферлі ерітіндінің фосфат/ цитрат, құрамында 3,6 mM ABTS. Субстрат ерітіндіні барлық шұңқырларға 100 мкл нен құяды. Планшетті айналмалы бұлғауышы бар термостатқа 370 С 15 минутқа салады. 8. 15 минуттан кейін барлық шұңқырларға реакция тоқтататын реагент құйылады. 100 мкл нен планшеттерді айналдырады шұңқырдағы құрамдарын араластыруға. Шұңқырларда 200 мкл - нен болу керек. 9. Зерттелудің боялуы планшетта фотометр көмегімен, 405 немесе 414 нм интерферен сүзгіні қолдану арқылы шығарады. 10. Қорытындыны әр түрлі айтуға болады, зерттейтін сары суының оң реакция пайызы, бақылау оң эталонды сары судың ең жоғарғы дәрежелі сұйылтуын ұсынады. 11. Қорытынды нәтижелері. Спектрофотометр нәтиже есебінде оң деп есептелінеді, зерттейтін сарысу сұйылту дәрежесі 1:400 ден басталғанда, теріс бақылау сары суынан ОТ екі есе жоғары болу керек. 12. Есепті көзбен қарағанда зерттелетін сары судан 1:400 сұйылтуында үш крестен кем емес, түрі қоңырсары боялғанда реакция оң деп есептелінеді, бақылау теріс сары суында және сынама сарысуларында ақшыл сары немесе ақ болған жағдайда реакция теріс деп есептейді. 13.Сынама сары суында күдікті нәтиже теріс болғанда,ОТ-саны екі есе жоғары болады.Сынама сарысудың қорытынды нәтижелері зертханаға балау бағасын (оң, теріс, күдікті және сары судың титрін нәтижеде белгілеу керек). 14. 15-20 күннен кейін қайталап зерттейді, екі рет күдікті реакция оң деп есептелінеді. жүктеу/скачать 4.84 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|