Инструкци я по применению набора реагентов для иммуноферментного определения аллерген-специфического иммуноглобулина е в сыворотке крови



жүктеу 113.83 Kb.
Дата19.06.2016
өлшемі113.83 Kb.

И Н С Т Р У К Ц И Я


по применению набора реагентов для иммуноферментного определения аллерген-специфического иммуноглобулина Е в сыворотке крови

(ИммуноФА-Аллерген)
1. НАЗНАЧЕНИЕ

Набор реагентов ИммуноФА-Аллерген предназначен для качественного определения аллерген-специфических антител класса E в сыворотке крови человека методом двухстадийного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на индикаторных полосках.

Набор позволяет проводить также полуколичественную оценку результатов в соответствии с классами RAST.

Иммуноглобулины класса Е (IgE) являются медиаторами аллергических реакций немедленного типа. Эти аллергические реакции развиваются при взаимодействии аллергена с фиксированными на клетках специфическими IgE. В результате активации иммуноглобулином Е тучных клеток и базофилов выделяется ряд цитокинов. При повторной встрече аллергена с сенсибилизированной тучной клеткой или базофилом он перекрестно связывается с IgE, фиксированным на поверхности эффекторных клеток. Это приводит к деградации клеток и высвобождению ими медиаторов аллергической реакции: ранее синтезированных – гистамина, протеаз; вновь синтезированных – лейкотриенов, простагландинов, а также цитокинов, усиливающих воспалительную реакцию и IgE-ответ. Результатом воздействия этих факторов является расширение периферических кровеносных сосудов, скопление эозинофилов и нейтрофилов в участке воздействия, повышение проницаемости капилляров, отек тканей, секреция слизи, сокращение гладкой мускулатуры. Период полураспада и выведения сывороточного IgE составляет 2 - 3 дня, для антител, связанных с тучными клетками и базофилами – несколько недель. У здоровых лиц концентрация IgE в сыворотке крови может достигать 100 - 200 МЕ/мл. У лиц, склонных к атопическим реакциям, наблюдается более высокий уровень циркулирующих антител класса Е, а также более высокое, чем в норме, содержание эозинофилов. Клинические симптомы аллергических реакций немедленного типа (атопии) многообразны и могут проявляться в виде бронхиальной астмы, поллиноза (аллергического ринита, аллергического конъюнктивита), аллергодерматозов (атопического дерматита, острой крапивницы) и др.

Исторически одной из первых иммуноаналитических тест-систем, использовавшихся для определения иммуноглобулинов Е к специфическим аллергенам в сыворотке крови, был радиоаллергосорбентный тест (RAST), в котором интенсивность реакции оценивалась в классах, соответствовавших определенным концентрациям антител IgE в сыворотке крови. Традиционно при полуколичественных анализах IgE применяется оценка результатов в классах RAST.

Определение содержания специфических иммуноглобулинов класса E в сыворотке крови используется в клинической практике для установления сенсибилизирующих аллергенов при диагностике аллергических заболеваний.

Набор рассчитан на проведение анализа 10 образцов сыворотки крови по 26 аллергенам (13 ингаляционным и 13 пищевым) каждый.
2. ПРИНЦИП МЕТОДА

Принцип метода - твердофазный двухстадийный иммуноферментный анализ. Аллергены, а также положительный и отрицательный контроли нанесены в виде линий на рабочую мембранную поверхность индикаторной полоски. При первой инкубации с сывороткой пациента специфические IgE-антитела сыворотки связываются с соответствующими аллергенами на твердой фазе. Несвязавшиеся компоненты отмывают. При второй инкубации к связавшимся молекулам IgE присоединяются анти-IgE мышиные моноклональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Связавшийся фермент после промывки выявляют с помощью цветной реакции с хромогеном. Появление заметной окраски линии, соответствующей по расположению соответствующему определяемому аллергену свидетельствует о наличии специфических IgE-антител к данному аллергену в сыворотке крови.


3. СОСТАВ НАБОРА:

- индикаторные полоски - полимерные полоски с рабочей зоной из мембраны белого цвета, на которую в виде линий нанесены препараты аллергенов, а также положительный и отрицательный контроли, в пакетах с осушителем - по 10 шт. двух наименований:




Ингаляционные аллергены

(зеленая маркировка):

Пищевые аллергены

(красная маркировка):

Положительный контроль

Отрицательный контроль

Клещ домашней пыли D. pteronyssimus

Клещ домашней пыли D. farinae

Эпидермис и шерсть кошки

Эпидермис и шерсть собаки

Таракан

Кандида


Альтернария+Аспергиллиус

Береза


Ежа

Тимофеевка

Полынь

Амброзия


Одуванчик

Положительный контроль

Отрицательный контроль

Треска

Креветки


Белок куриного яйца

Желток куриного яйца

Молоко коровье

Лесной орех

Арахис

Соя


Морковь

Апельсин


Клубника

Пшеничная мука

Томаты



Примечание: допускается изначальная слабая желтоватая или сероватая пигментация линий некоторых аллергенов.

- конъюгат анти-IgE мышиных моноклональных антител с пероксидазой, готовый для использования – 1 фл. (12 мл);

- проявляющий раствор, готовый для использования - 1 фл. (12 мл);

- пробирки пластиковые вместимостью 0,6 мл – 30 шт.;

- флакон пластиковый вместимостью 20 мл для промывания полосок – 1 шт.
4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

Специфичность. В наборе используются высокоспецифические анти-IgE мышиные моноклональные антитела, которые не обнаруживают перекрестного связывания с IgA, IgM и подклассами IgG.

Чувствительность. Минимальная определяемая набором концентрация IgE соответствует приблизительно 1-му классу RAST(около 0,35 МЕ/мл).

5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ


Потенциальный риск применения набора - класс 1.

Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

При работе с набором и утилизации отходов следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).

При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и другие возбудители вирусных инфекций.


6. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ

- Дозаторы полуавтоматические пипеточные со сменными одноразовыми наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 50-200 и 200-1000 мкл (одноканальные), аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования;

- штатив для маленьких пробирок (типа Эппендорф);

- шейкер горизонтальный;

- секундомер или часы;

- вода дистиллированная;

- перчатки резиновые или пластиковые, одноразовые.
7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

7.1. Поставить в штатив пластиковые пробирки по количеству исследуемых образцов.



7.2. Достать из упаковок по одной индикаторной полоске с зеленой и красной маркировкой (держать за цветную часть) для каждого исследуемого образца. Подписать полоски на цветной части тонким фломастером и их вставить вместе (изнаночной стороной друг к другу) в пробирку. Возможна раздельная постановка ингаляционной и пищевой панелей.

Примечание: не рекомендуется прикасаться к рабочей зоне (белая мембрана) индикаторной полоски.

Затем в каждую пробирку внести образец – по 0,5 мл неразведенной сыворотки крови так, чтобы сыворотка покрывала всю белую мембрану. Проследить, чтобы внутри пробирки не осталось пузырьков воздуха (при наличии пузырьков воздуха постучать по пробирке, извлечь и опустить несколько раз полоски).



Примечание: обратите внимание на то, что образцы сывороток добавляются к пробиркам, в которые уже вставлены индикаторные полоски.

7.3. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре (+20-+25С) на шейкере при легком встряхивании (либо встряхивая пробирки вручную через каждые 10-15 мин). Для увеличения чувствительности рекомендуется увеличить время инкубации до 10-15 часов (ночная инкубация с сывороткой) при комнатной температуре. Во избежание испарения сыворотки в случае ночной инкубации пробирку с индикаторной полоской следует накрыть (например, химической пробиркой или стаканом).

7.4. Извлечь полоски из пробирок, ополоснуть струей дистиллированной воды. Опустить полоски в пластиковый флакон вместимостью 20 мл и налить в него дистиллированную воду до сужения горлышка, так чтобы она полностью покрывала рабочую зону полосок. Промыть полоски, поместив флакон на шейкер, либо «прополаскивая» их во флаконе вручную, в течение 2-3 мин. Повторить промывку еще 2 раза, каждый раз меняя дистиллированную воду.

7.5. Поместить индикаторные полоски в чистые пластиковые пробирки. Затем в каждую пробирку внести по 0,5 мл раствора конъюгата. Обратить внимание на то, что раствор конъюгата должен покрывать ВСЮ рабочую зону полоски.

7.6. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере.

7.7. Извлечь полоски из пробирок, ополоснуть дистиллированной водой и промыть, как описано в п. 8.4, не менее 3-х раз.

7.8. Поместить индикаторные полоски в чистые пластиковые пробирки. Затем в каждую пробирку внести по 0,5 мл проявляющего раствора (проявляющий раствор должен покрывать ВСЮ рабочую зону полоски) и инкубировать 10-15 мин при комнатной температуре (+20-+25С).

Примечание: не допускать высыхания индикаторных полосок на промежуточных стадиях проведения анализа.

7.9. Извлечь индикаторные полоски из пробирок, ополоснуть струей дистиллированной воды, положить на чистый лист бумаги мембраной вверх и оставить сушиться примерно на 20 мин при комнатной температуре в темноте.


8. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

8.1. Учет результатов проводится визуально на полностью высохших индикаторных полосках.

Оценка результатов – качественная (путем сопоставления линий на исследуемой индикаторной полоске и на трафарете) и затем, при необходимости, полуколичественная (путем визуального сравнения интенсивности окраски линии аллергена на индикаторной полоске с цветовой «Шкалой приблизительного соответствия интенсивности окраски классам RAST»).

8.2. При качественной оценке результатов приложить индикаторную полоску к вложенному в набор трафарету так, чтобы линия положительного контроля на полоске совпала с линией положительного контроля на трафарете.

При правильно проведенном анализе линия положительного контроля окрашена в сине-фиолетовый цвет, а отрицательного контроля – не окрашена.

В случае положительной реакции на какие-либо аллергены линии соответствующих аллергенов имеют сине-фиолетовую окраску.

8.3. При полуколичественной оценке результатов производится визуальное сравнение интенсивности окраски линии аллергена на индикаторной полоске с цветовой шкалой карточки «Шкала приблизительного соответствия интенсивности окраски классам RAST».

Интенсивность окраски каждого прямоугольника на карточке соответствует началу класса RAST. Например, если интенсивность окраски линии аллергена на полоске находится между 1+ и 2+, то это соответствует 1-му классу RAST.

В таблице приведено приблизительное соответствие класса RAST содержанию аллерген-специфических антител класса E в сыворотке крови.


Класс RAST

Концентрация аллерген-специфических антител IgE, МЕ/мл

Интерпретация результатов

0

< 0,35

Отсутствие или наличие очень небольшого количества аллерген-специфических антител класса E

1

0,35 - 0,70

Низкий уровень антител

2

0,71 - 3,50

Средний уровень антител

3

3,51 - 17,50

Высокий уровень антител

4

> 17,50

Очень высокий уровень антител


9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА

9.1. Набор реагентов ИммуноФА-Аллерген должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности - 12 мес. Допускается хранение набора при температуре до +25 оС не более 7 суток. Замораживание компонентов набора не допускается.

9.2. Неиспользованные индикаторные полоски после вскрытия упаковки могут храниться в том же пакете (с осушителем), плотно закрытом или заклеенном липкой лентой, при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности.

9.3. Конъюгат и проявляющий раствор после вскрытия флаконов можно хранить при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности.

9.4. Следует избегать воздействия яркого света на реагенты во время хранения и инкубации.

9.5. До проведения анализа возможно хранение образцов сыворотки крови не более 2 дней при температуре +(2-8)оС или в замороженном состоянии при температуре минус 20оС не более 2 месяцев.

Допускается только однократное замораживание и размораживание образцов сыворотки крови. После размораживания образцы следует тщательно перемешать. Тепловая инактивация сывороток не допускается.

9.6. Исключается использование для анализа гемолизированных и мутных образцов сыворотки крови.

9.7. Не допускается использование проявляющего раствора из наборов, производимых другими фирмами.

9.8. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.


По вопросам, касающимся качества набора ИммуноФА-Аллерген, следует обращаться в ЗАО «НВО Иммунотех», почтовый адрес: 119991, Москва, Ленинские Горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, ул. Менделеевская, стр.11а, тел. 939-46-83, факс 932-88-96; электронный адрес: support@immunotek.ru; http://www.immunotek.ru.

ТРАФАРЕТ
Ингаляционные аллергены (зеленая маркировка)



-Положительный контроль

-Отрицательный контроль

-Клещ домашней пыли Dermatophagoides pteronyssimus

-Клещ домашней пыли Dermatophagoides farinae

-Эпидермис и шерсть кошки

-Эпидермис и шерсть собаки

-Таракан


-Кандида

-Альтернария+Аспергиллиус

-Береза

-Ежа


-Тимофеевка

-Полынь


-Амброзия

-Одуванчик


ТРАФАРЕТ

Пищевые аллергены (красная маркировка):





-Положительный контроль

-Отрицательный контроль

-Треска


-Креветки

-Белок куриного яйца

-Желток куриного яйца

-Молоко коровье

-Лесной орех

-Арахис


-Соя

-Морковь


-Апельсин

-Клубника



-Пшеничная мука

-Томаты


©dereksiz.org 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет