Инструкция 10-15-21-2006 микробиологические методы выделения и идентификации возбудителей

При серологической идентификации во внимание принимаются три основных антигена (О, Н, Vi). Этот принцип положен в основу диагностической антигенной схемы Кауфмана-Уайта. Основным методом типирования сальмонелл остается серотипирование, точный метод используемый для эпидемиологической характеристики возбудителя. Современные молекулярно-генетические методы не заменяют серотипирование, а лишь дополняют его, позволяя дифференцировать штаммы в пределах одного серотипа. До настоящего времени для серотипирования сальмонелл в Республике Беларусь применяется схема Кауфмана-Уайта, содержащая сведения о серотипах сальмонелл, известных на 31 декабря 1970 года.

В соответствии с рекомендациями Референс-центра Всемирной Организации Здравоохранения по исследованию сальмонелл (институт Пастера, Париж), в большинстве стран мира для серотипирования сальмонелл и эпидемиологического надзора за сальмонеллезами применяется схема Кауфмана-Уайта (2001). В ней содержатся сведенья о серотипах сальмонелл известных на 31 декабря 2000 года с учетом изменений в таксономии рода Salmonella и номенклатуре серотипов, полученные за последние 30 лет в результате молекулярно-генетических исследований, схема насчитывает 2501 серологический вариант. Сокращенная схема Кауфмана-Уайта согласно приложению 3 к настоящей Инструкции.

Полнотекстовую версию схемы Кауфмана-Уайта (2001) можно получить на сайте ГУ РЦГЭиОЗ www.rcheph.by

Критерии диагностики. Доказательством этиологической роли возбудителя является выделение возбудителя одного и то же серологического типа с дальнейшим определением биоваров и фаговаров (эпидемиологических маркеров), определением антибиотикограммы от больных, подозреваемых источников инфекции (людей или животных - больных или бактерионосителей) и возможных факторов передачи инфекции.

С целью выявления возможного источника инфекции и подтверждения клинического диагноза у больных необходимо проведение серологических исследований для обнаружения в сыворотке крови обследуемых специфических антител.

Бактериологические исследования клинического материала.

Первый день. Испражнения суспендируют в ИХН в соотношении 1:5 или 1:10 и засевают в чашки Петри с дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфит агар, Плоскирева, Эндо, агар с эозин-метиленовым синим (далее ЭМС-агар)) и одновременно не разведенные испражнения вносят в среду обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду, среды Мюллера или Кауфмана), в соотношении 1:5. Для одновременного выделения шигелл и сальмонелл целесообразно использовать высокоселективные среды (среда для сальмонелл и шигелл (SS-агар)), ксилозо-лизин-дезоксихолатный (XLD-агар).

Если испражнения доставлены в консерванте, каплю взвеси наносят на поверхность плотной среды у края чашки и тщательно растирают стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности среды и одновременно, испражнения доставленные в фосфатно-буферной смеси, засевают в среду обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1, в глицериновом консерванте – в среду обогащения обычной концентрации в соотношении 1:5.

При взятии материала ректальным тампоном его погружают в среду обогащения после посева на пластинчатые среды.

Кровь засевают в 10-20% желчный бульон или среду Рапопорт в соотношении 1:10.

Мочу после центрифугирования или без него, засевают в чашки Петри с плотными средами (Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агар, ЭМС-агар), а также среды обогащения, не центрифугированную мочу – в среды двойной концентрации в соотношении 1:1.

Желчь (дуоденальное содержимое) засевают в чашки с плотными средами (Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агар, ЭМС-агар) и во флаконы со слабощелочным питательным бульоном в соотношении 1:10. В последующие 3-5-7 сутки делают высевы на плотные среды, как из бульона, так и из пробирок с дуоденальным содержимым, которые содержат в термостате при температуре 37⁰С.

Рвотные массы и промывные воды засевают на плотные среды (Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агар, ЭМС-агар) и в среды обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1.

Спинномозговую жидкость засевают в среды обогащения и на плотные среды (Эндо, ЭМС-агар).

Пунктат воспалительных очагов засевают на плотные среды и в среды обогащения в соотношении 1:5.

При исследовании секционного материала кусочки органов, мезентериальные узлы и отмытые от содержимого кусочки кишечника тщательно размельчают с добавлением нескольких миллилитров ИХН. После отстаивания взвеси надосадочную жидкость засевают пипеткой на плотные среды и в среды обогащения. Кровь, мочу, желчь исследуют соответственно.

Все посевы помещают в термостат при температуре 37⁰С на 18-20 часов.

Второй день. Просматривают посевы на плотных питательных средах в чашках Петри и пересевают подозрительные колонии в пробирку с комбинированой средой (Клиглера, Олькеницкого, трехсахарный агар с солями железа (ТSI) и др.). Посевы инкубируют в термостате при температуре 37⁰С, 18-24 ч.

На висмут-сульфит агаре сальмонеллы, как правило, растут в виде черных колоний, с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией, а также зеленоватых с темно-зеленым ободком.

На среде Плоскирева колонии бесцветны, но более плотные и несколько меньших размеров.

На среде Эндо (Мак-Конки) сальмонеллы растут в виде круглых, бесцветных или слегка розоватых прозрачных нежных колоний.

На ЭМС-агаре колонии прозрачные, слабо-розовые или розово-фиолетовые.

На SS-агаре, на XLD-агаре сальмонеллы образуют колонии красного цвета с черным центром, за счет образования H₂S.

Посевы на висмут-сульфит агаре просматривают дополнительно через 48 часов.

Производят высев из среды обогащения на плотные питательные среды.

Из посевов желчи в бульон и из исходной желчи, содержащихся в термостате, производят высев на чашки со средами Эндо, Плоскирева и висмут-сульфит агаром.

Из посева крови в 10-20% желчный бульон или среду Рапопорт производят высев на чашку со средой Эндо, а исходный посев крови снова помещают в термостат, высевы повторяют на 3-4-6 и 10 сутки.

Третий день. Производят идентификацию культур, высеянных на комбинированую среду. По совокупности биохимических свойств, выявленных на комбинированной среде, делают предварительное заключение о возможной принадлежности культуры к роду сальмонелла, а также подбирают необходимый минимум дифференциальных тестов для определения рода и производят посевы на соответствующие среды, согласно приложению 4 к настоящей Инструкции. На этом этапе также проводят ориентировочную серологическую пробу в реакции агглютинации на стекле с поливалентными сыворотками (АВСДЕ и редких групп).

Типичными для бактерий рода Salmonellа являются культуры, ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, образующие сероводород. Дальнейшему изучению подвергают также лактозоположительные бактерии, или бактерии не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа.

На третий день исследования производят также просмотр чашек с посевами из сред обогащения, и подозрительные колонии отсевают на комбинированную среду.

Если при первичном посеве и при высеве из сред обогащения подозрительных колоний не обнаружено, может быть выдан ответ об отрицательном результате исследования.

Посевы на висмут-сульфит агаре (из среды обогащения) независимо от результатов просмотра оставляют в термостате еще на 24 часа.

В этот же день просматривают чашки с первым высевом из флакона с засеянной кровью и дуоденальным содержимым, подозрительные колонии пересевают на комбинированную среду.

На третий день также производят посев выделенной культуры для испытания ее на чувствительность к сальмонеллезному О-фагу, являющемуся высокоспецифичным для этих бактерий, он лизирует 97,5 % штаммов сальмонелл. Для этого две капли четырех- или восемнадцати-часовой бульонной культуры испытуемого штамма наносят тонкооттянутой пастеровской пипеткой или петлей (диаметр 0,4-0,5 мм) на хорошо подсушенный слабощелочной агар в чашки Петри. После подсыхания на одну из капель, петлей или пастеровской пипеткой меньшего диаметра, наносят О-бактериофаг, а на другую, в качестве контроля - каплю бульона. Фаг наносят в рабочем разведении, указанном на этикетке. Чашки с нанесенными культурами и О-бактериофагом помещают в термостат при 37°С на 18-20 часов, после чего учитывают результаты. Появление на месте нанесения фага четко очерченной зоны сливного лизиса или большего или меньшего числа негативных колоний, отчетливо видимых невооруженным глазом, свидетельствует о чувствительности культур к бактериофагу. При отсутствии лизиса в местах нанесения фага будет сплошной рост культуры, как в контроле. О-фаг может быть использован для предварительного испытания культуры из колонии с чашки с дифференциальной средой.

Культура, лизировавшаяся О-фагом, является подозрительной на сальмонеллу и может быть прямо с чашки испытана в реакции агглютинации со смесью сальмонеллезных О-сывороток. Атипичные сальмонеллезные культуры в большинстве случаев чувствительны к О-фагу, в то время, как культуры, лишь сходные с сальмонеллами по биохимическим свойствам (например, лактозонегативные E.coli), как правило, не лизируются этим фагом.

Четвертый день. Производят учет результатов, биохимических тестов, выделенных культур. После подтверждения биохимическими тестами принадлежности культуры к роду Salmonellа, проводят окончательную серологическую идентификацию. Для идентификации используют культуру выросшую на слабощелочном питательном агаре.

Серологическую идентификацию (определение серовара) сальмонелл начинают с испытания их в реакции агглютинации на стекле с поливалентной адсорбированной О-сывороткой к сальмонеллам групп ABCDE. При отсутствии реакции с указанной смесью, культуру испытывают с поливалентной сывороткой, включающей антитела к антигенам сальмонелл редких групп (11, 13, 15, 19, 22, 23 и др.). При получении положительных результатов с поливалентной сывороткой ABCDE культуру испытывают с отдельными О-сыворотками, для определения принадлежности ее к одной из О-групп.

После установления принадлежности культуры к какой-либо О-группе (A,B,C,D,E) определяют полную структуру ее О-антигена, а затем испытывают культуру с монорецепторными Н-сыворотками, сначала первой фазы, а затем – второй и таким образом устанавливают антигенную формулу выделенной культуры, т.е. ее серовар в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта

Для агглютинации с О-сыворотками культуру следует брать с верхней части роста на скошенном агаре, для агглютинации с Н-сыворотками - из самой нижней части роста культуры или из конденсата, где располагаются особи с наиболее развитым Н-антигеном.

При серологической идентификации культуры возможны трудности в выявлении Н-антигена или одной из его фаз. Для выявления отсутствующей фазы Н-антигена используют феномен роения по Свену - Гарду. Принцип его заключается в том, что на неплотном агаре (0,9-1%) роятся все подвижные микробы.

Если добавить к агару 1-2 капли сыворотки известной нам фазы, т.е. той фазы, которая была определена, то она свяжет выявленный антиген, а особи микробов, богатые другим, неизвестным антигеном будут бурно роиться. Этот антиген легко может быть выявлен при испытании культуры, взятой с края макроколонии, в реакции агглютинации. Для приготовления 1,0% агара к 15 мл 2% агара добавляют 15 мл мясопептонного бульона. Охлаждают до 45⁰С, выливают в чашку Петри, подсушивают в термостате при 37⁰С – 15-20 мин. В центр чашки на агар наносят 1-2 капли сыворотки, соответствующей выявленной фазе Н-антигена. После того, как сыворотка впитается в агар, на то же место петлей наносят испытуемую культуру (18-часового роста на скошенном агаре), диаметром 3-4 мм. Чашки инкубируют при 37⁰С в течение 18-20 часов. На следующий день с края микроколонии берут культуру и испытывают ее в реакции агглютинации на стекле с соответствующими монорецепторными Н-сыворотками.

В этот же день производят просмотр чашек со вторым высевом дуоденального содержимого из бульона и третий высев из последнего на плотные среды. При отрицательных результатах первых двух высевов из желчного бульона с посевом крови, высевы повторяются на 5-й и 10-й дни.

При идентификации культур, подозрительных на сальмонеллы, чаще всего вызывают затруднение бактерии биохимически сходные с сальмонеллами, но не агглютинирующиеся сальмонеллезными сыворотками, либо дающие агглютинацию, но отклоняющиеся по биохимическим свойствам.

В таких случаях, прежде всего, необходимо убедиться в чистоте культуры, для чего следует произвести ее рассев на чашку со средой Эндо, отобрать наиболее типичные колонии и подвергнуть их дополнительному изучению.

В случае выделения культур, агглютинирующихся смесью О-сывороток редких групп, но не агглютинирующихся ни одной из О-сывороток, входящих в смесь, необходима постановка дополнительных биохимических тестов. Тесты с помощью которых проводят дифференциацию бактерий рода Salmonellа с другими представителями других родов семейства Enterobacteriaceae, согласно приложению 5 к настоящей Инструкции.

Исследование пищевых продуктов.

Неселективное предварительное обогащение. Навеску продукта, в массе (объеме) которой нормативно-технической документацией на анализируемый продукт предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonellа, засевают в забуференную пептонную воду. Соотношение массы (объема) продукта и забуференной пептонной воды 1:9. При посеве жидких высококислотных продуктов рН продукта перед посевом доводят до 7,0±0,2. При посеве твердых высококислотных продуктов доводят рН до 7,0±0,2 в посевах. Доведение рН проводят асептически при помощи стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты. Посевы инкубируют при температуре 37⁰С в течение 18-20 часов.

Селективное обогащение. Культуры полученные после инкубирования пересевают в две среды для селективного обогащения. Для этого 10 см³ культуры переносят в 100 см³ магниевой (селенитовой) среды и в 100 см³ тетратионатной среды. Посевы инкубируют в течение 24-48 часов на магниевой (селенитовой) среде при температуре 37⁰С, а на тетратионатной среде - (43±1)°С.

Выделение и идентификация культур на агаризованных дифференциально-диагностических средах. Культуры через 24-48 часов пересевают со сред обогащения на дифференциально-диагностические питательные среды (висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо (или Левина)), инкубируют при 37⁰С в течение 24-48 часов.

После 24 часов инкубирования проводят предварительный учет результатов, а после 48 часов - окончательный. Отмечают рост колоний характерных для бактерий рода Salmonellа на дифференциально-диагностических средах. Характеристика колоний описана выше. При наличии характерных колоний проводят их дальнейшее изучение. Проводят высев со сред обогащения через 48 часов инкубирования на дифференциально-диагностические среды.

Проводят окончательный учет результатов. При отсутствии в посевах характерных для бактерий рода Salmonellа колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonellа в анализируемой навеске продукта. При наличии характерных колоний проводят их дальнейшее изучение как описано выше.

Для уменьшения риска получения ложно отрицательных результатов существуют многочисленные методы выделения сальмонелл.

Одним из таких методов является метод в соответствии с ISO-6579 стандартом. При выделении сальмонелл из пищевых продуктов и испражнений проводится предварительное обогащение на неселективной питательной среде больших порций образца и селективное обогащение с использованием двух селективных сред. Объем образца определяет чувствительность исследования, чем больше объем исследуемого образца, тем выше чувствительность исследования. Важно, что соотношение между объемом образца и бульоном предобогащения должно составлять 1:9.

Первый день. Неселективное предобогащение. К 25 г пищевого продукта или испражнений добавить 225 мл забуференной пептонной воды (соотношение объема образца и воды 1:9), перемешать, инкубировать при 37⁰С 16-20 часов.

Второй день. Селективное обогащение. Поместить 1 мл предобогащенной смеси в 10 мл тетратионатного бульона (Мюллер-Кауфмана), инкубировать при 37⁰С 18-24 часа, 0,1 мл предобогащенной смеси поместить в 10 мл Рапопорт-Вассилиадис соево- пептонного бульона, инкубировать при 41,5⁰С 18-24 часа.

Третий день. Посев образцов на элективные питательные среды. Образцы из тетратионатного бульона и Рапопорт-Вассилиадис соево- пептонного бульона высеять петлей на XLD-агар и агар с бриллиантовым зеленым (BGA-агар), инкубировать при 37⁰С 18-24 часа.

Четвертый день. Регистрация результатов посева на XLD-агаре и BGA-агаре. На XLD-агаре колонии типичные для рода сальмонелла имеют красную периферическую зону с черной центральной частью. Иногда периферическая часть колоний может быть розового цвета. На BGA-агаре цвет колоний варьирует от розово-серого до красного. Отсев подозрительных колоний на простой питательный агар для дальнейшей биохимической идентификации и серотипирования.

Пятый день. Биохимическое подтверждение и серотипирование сальмонелл.

Колонии выделенной чистой культуры, выращенной на питательном агаре инокулировать на: TSI-агар, агар с мочевиной, L – лизин-декарбоксилазный тест, тест на β – галактозидазу, реакцию Фогес-Проскауэр, тест на индол. Инкубировать при 37⁰С 18-24 часа. Серотипирование сальмонелл выполяется путем идентификации О-антигена и Н-антигенов как описано выше.

Шестой день. Регистрация результатов биохимической идентификации. Биохимические свойства бактерий рода сальмонелла согласно приложению 6 к настоящей Инструкции.

ГЛАВА 4

БАКТЕРИИ РОДА SHIGELLA

Шигеллы – прямые грамотрицательные неподвижные палочки с закругленными концами (0,7-1,0 х 1-3мкм), оксидазоотрицательные, каталазоположительные, не образуют спор. Хемоорганотрофы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма. Факультативные анаэробы, оптимальная температура роста 37°С.

Пищевые продукты, содержащие бактерии рода Shigella могут быть причиной заболеваний, протекающих по типу пищевых бактериальных отравлений. Среди продуктов, которые могут вызвать массовые заболевания, протекающие клинически по типу пищевой токсикоинфекции, чаще всего регистрируются молоко и молочные продукты, изделия из отварного мяса (паштеты, мясные салаты).

Шигеллы довольно устойчивы во внешней среде: на ткани и бумаге сохраняются до 1 месяца, в высохших испражнениях до 5 месяцев, в почве-3-4 месяца, в воде до 15 дней. На овощах и фруктах остаются живыми не более 2 недель, в молоке и молочных продуктах - несколько недель. При 60°С погибают в течение 15-20 минут, при кипячении-мгновенно.

Биохимические свойства бактерий рода Shigella, согласно приложению 8 к настоящей Инструкции, свидетельствуют о малой биохимической активности этих бактерий. Ряд реакций характерен для представителей всего рода. Так, все шигеллы неподвижны, не образуют сероводорода из неорганических соединений серы, не гидролизуют мочевину, не утилизируют малонат натрия, цитрат в среде Симонса как единственный источник углерода и D-тартрат, не продуцируют ацетоин в реакции Фогес-Проскауэра, не обладают фенилаланиндезаминазой, лизиндекарбоксилазой и желатиназой, не вызывают щелочения среды Кристенсена, не растут в присутствии KCN, не ферментируют адонит и инозит, но дают положительную реакцию с метиловым красным. Образование индола вариабельно.

Шигеллам отдельных видов присущи свои биохимические особенности, согласно приложению 9 к настоящей Инструкции.

Характерным для S.dysenteriae является их слабая ферментативная активность, они ферментируют глюкозу без газообразования. Поскольку они не разлагают маннит, а другие виды его ферментируют, они также известны как маннитнегативные шигеллы.

Более биохимически активны S.flexneri сероваров 1-5 и варианты X и Y, которые постоянно ферментируют маннит, трегалозу, а вариабельно-мальтозу, сорбит, арабинозу, рафинозу, рамнозу и некоторые штаммы-замедленно сахарозу. Своеобразна способность S. flexneri 6 сбраживать или не сбраживать маннит и образовывать газ в глюкозе.

S.boydii также относятя к маннитположительным видам. По большинству биохимических реакций они вариабельны. К числу отрицательных относят реакции в средах с лактозой, сахарозой и орнитином (кроме серовара 13.).

Наиболее активны по ферментативным свойствам S.sonnei. Они способны, хотя и замедленно ферментировать лактозу и сахарозу, постоянно ферментируют маннит, рамнозу, мальтозу, арабинозу, трегалозу, обладают арнитиндекарбоксилазой и β-галактозидазой, вариабельны по утилизации муката и сбраживанию ксилозы, рафинозы, глицерина, целлобиозы; постоянно отрицательны в отношении дульцита, индола.

Антигенная структура шигелл представлена О- и К-антигенами. Термолабильные оболочечные К-антигены обнаружены у всех шигелл (за исключением S. flexneri и S. sonnei). Они способны маскировать О-антигены и тем самым блокировать агглютинацию бактерий О-антисыворотками (действие снимают кипячением в течение 1 часа). Термостабильные соматические О-антигены разделяют на типовые и групповые. Соответственно шигеллы разделяют на подгруппы (виды). Вид S.dysenteriae (подгруппа А) представлен 12 сероварами, в своем большинстве серологически обособленными. Вид S.flexneri (подгруппа В) имеет 13 сероваров и подсероваров, перекрестно реагирующих между собой за счет мночисленных групповых антигенов. Вид S.boydii (подгруппа С) представлен 18 сероварами, не имеющим между собой заметного антигенного родства, за исключением тесно связанных сероваров 10 и 11. Вид S.sonnei (подгруппа Д) серологически однороден.

Критерии диагностики. Доказательством этиологической роли возбудителя является выделение в очаге шигелл определенного серовара (подсеровара) от больных, подозреваемых источников инфекции (больных или бактерионосителей), из продуктов питания, смывов и т. д., идентичных по биовару о другим эпидемиологическим маркерам.

Для выявления источника инфекции и подтверждения клинического диагноза у больных возможно проведение серологических исследований (РПГА) с целью обнаружения в сыворотке крови обследуемых специфических антител,.

Бактериологические исследования.

Первый день. Обнаружение шигелл в исследуемом клиническом материале и пищевых продуктах проводят параллельно с обнаружением сальмонелл в тех же посевах и на тех же средах, описание которых приведено в главе 3 настоящей Инструкции. В качестве среды обогащения для шигелл применяют селенитовый бульон.

Второй день. Просматривают чашки с посевами. На диффернциально-диагностических средах шигеллы образуют небольшие (1-1,5 мм), круглые, слегка выпуклые, с ровными краями, бесцветные колонии, блестящей поверхностью, полупрозрачные, легко снимающиеся петлей с поверхности агара. Одновременно могут находиться колонии гладкой, шероховатой и переходной формы. Колонии отсевают на комбинированную среду (Клиглер, Олькеницкого и др). С селенитовой среды накопления производят пересев на среды Плоскирева, Эндо, SS-агар. Все посевы инкубируют при 37⁰С 18-20 часов.

Третий день. Просматривают чашки с пересевами из селенитовой среды обогащения и отсевают подозрительные колонии на комбинированную среду, инкубируют при 37⁰С 18-20 часов.

Проводят идентификацию культур высеянных накануне на комбинированную среду.

Для дальнейшего изучения отбирают культуры грамотрицательных палочек с характерными свойствами для шигелл: не расщепляющие лактозу и мочевину, не образующие сероводород, не образующие газ при ферментации глюкозы (исключая газообразование подвида S. flexneri), неподвижные. Среди S. sonnei встречаются биохимические варианты, ферментирующие лактозу до кислоты. На этом этапе изучаемые культуры подвергают дальнейшей биохимической идентификации, с использованием тестов минимального дифференцирующего ряда согласно приложению 4 к настоящей Инструкции, проводят ориентировочную серологическую пробу с основной поливалентной сывороткой, содержащей антитела к S.flexneri 1-6 и S. sonnei.

Четвертый день. Производят окончательную идентификацию культур по биохимическим свойствам и серологическую идентификацию.

При идентификации выделенных культур могут возникнуть некоторые затруднения: выделение культур шигелл с отклонениями от типичной характеристики по ферментативной активности, например, встречаются маннитнегативные варианты S.sonnei и S.flexneri, маннитферментирующие разновидности S.dysenteriae серовары 3-7, ксилозоферментирующий вариант S. flexneri, лактозоферментирующий вариант S.boydii; выделение инагглютинабильных дизентерийных культур: из-за наличия поверхностного антигена «К», в этом случае прогревание культуры в течение 1-1,5 часов при 100⁰С разрушает термолабильный К-антиген и агглютинация с О-сывороткой восстанавливается; из-за утраты типоспецифического антигена S.flexneri, селекционирование отдельных колоний с питательного агара, обладающих полным антигенным комплексом, позволяет выяснить истинный серовар культуры; выделение атипичных представителей семейства Enterobacteriaceae, обнаруживающих сходство по биохимическим и серологическим свойствам с шигеллами. Дифференциальные биохимические признаки некоторых представителей наиболее часто встречающихся родов семейства Enterobacteriaceae, представлены в приложении 5 к настоящей Инструкции.

Серологическую идентификацию шигелл начинают с основной поливалентной сыворотки, содержащей антитела S.flexneri 1-6 и S.sonnei. При положительном результате используют поливалентные сыворотки к S.flexneri и S.sonnei. Определение серовара S.flexneri начинают с применения сероварспецифических (типовых) сывороток (I, II, III, IV, V, VI,), а затем групповых (3, 4; 6; 7; 8), выявляющих подсеровар. Иногда свежевыделенные штаммы слабо агглютинируются. Необходимо провести 1-2 пассажа 4-часовой бульонной культуры с высевом на питательный агар, проверить чистоту культуры. При отсутствии агглютинации в основной поливалентной сыворотке штамм необходимо испытывать с поливалентными сыворотками к S. dysenteriae. Сбраживающие маннит штаммы с поливалентными сыворотками к S. boydii. Штаммы, обладающие культуральными и биохимическими свойствами, типичными для шигелл, но не агглютинирующиеся шигеллезными сыворотками, следует испытывать с сыворотками провизорных сероваров.

Дополнительно целесообразно исследовать чувствительность выделенных культур к поливалентному дизентерийному фагу. Для этого используют следующую методику: на хорошо подсушенную чашку со слабо щелочным агаром (рН 7,6) наносят пастеровской пипеткой каплю смыва 18-20 часовой агаровой культуры. На подсохшие капли пастеровской пипеткой наносят дизентерийный бактериофаг, после подсушивания чашки инкубируют при 37⁰С в течение 18-20 часов. При положительном результате наблюдается задержка роста культуры на чашках с бактериофагом.

В затруднительных случаях при идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae рекомендуется применить кератоконъюктивальную пробу на морских свинках. При постановке этой пробы полную петлю (диаметром 5 мм) суточной агаровой культуры вносят в конъюктивальный мешок глаза морской свинки под нижнее веко. Подавляющее большинство свежевыделенных дизентерийных бактерий вызывает у морских свинок специфический кератоконъюнктивит на 2-5 сутки: конъюнктива гиперимирована, роговица мутная, набухшая, с белесоватым оттенком, обильное гнойное отделяемое.

Кроме шигелл кератоконъюнктивит могут вызывать патогенные кишечные палочки серотипа 0124:В17 и очень редко некоторые сальмонеллы (например - S. typhimurium), но эти энтеробактерии легко дифференцируются от шигелл по их биохимическим свойствам.

Для установления эпидемиологической метки (маркера-штамма) существует ряд методов.

Метод определения биовара основан на вариабельной способности различных штаммов шигелл ферментировать некоторые углеводы, или образовывать индол.

Метод определения биоваров S.sonnei основан на неодинаковой активности в отношении ксилозы, рамнозы и мальтозы, что позволяет подразделить их на 7 стабильных биоваров согласно приложению 10 к настоящей Инструкции.

Для определения биоваров S.flexneri 6 используют неодинаковую ферментацию ими глюкозы, маннита и дульцита, что позволяет выявить среди них 3 различных биовара согласно приложению 11 к настоящей Инструкции. Определение биоваров S. flexneri 1-5 Х- и Y-variant основано на биохимической активности в отношении мальтозы, арабинозы, сорбита и рамнозы, что позволяет разделить их на 15 биоваров согласно приложению 12 к настоящей Инструкции.

Установление биоваров S.boydii основано на неодинаковой активности их в отношении сорбита, глицерина, ксилозы, дульцита, что позволяет дифференцировать их на 8 биоваров согласно приложению 13 к настоящей Инструкции.

ГЛАВА 5

БАКТЕРИИ РОДА ESCHERICHIA

Род образуют подвижные или неподвижные прямые палочковидные бактерии c закругленными концами, размером 0,6-1х2,0-6,0 мкм, многие имеют капсулу или микрокапсулу. Грамотрицательные, в мазках располагаются одиночно или парами. Факультативные анаэробы. Температурный оптимум для роста 37⁰С, ферментируют углеводы с образованием кислоты или кислоты и газа, оксидазоотрицательны и каталазоположительны.

Особенность рода состоит в том, что непатогенные разновидности эшерихий являются постоянными обитателями кишечника человека, животных, птиц и широко распространены в природе. Эшерихии – основная факультативно-анаэробная микрофлора кишечника человека. Основное медицинское значение имеет кишечная палочка (Escherichia сoli), являющаяся типовым видом рода Escherichia. Наряду с кишечными палочками, обладающими непатогенными свойствами, имеются серовары обладающие свойствами патогенных возбудителей, они являются возбудителями эшерихиозов у человека.

E. сoli имеют типичную для энтеробактерий форму и представлены короткими подвижными палочками с закругленными концами. На плотных средах бактерии образуют плоские выпуклые мутные S - колонии с ровными или слегка волнистыми краями (3-5 мм в диаметре), либо сухи плоские R - колонии с неровными краями. В жидких средах растут диффузно, вызывая помутнение среды и образование осадков. На селективно-дифференциальных средах колонии принимают цвет соответствующий окраске среды. На агаре Эндо лактозоположительные эширихии образуют фуксиновокрасные колонии с металлическим блеском, лактозоотрицательные – бесцветные, на среде Плоскирева - соответственно красные с желтым оттенком. Биохимические свойства E. сoli согласно приложению 18 к настоящей Инструкции.

Эшерихии ферментируют углеводы с кислотообразованием: постоянно - глюкозу (с газом или без него), маннит; обычно ферментирует лактозу (иногда замедленно), не ферментирует адонит и инозит (крайне редко наблюдаются положительные реакции): другие углеводы и многоатомные спирты сбраживают вариабельно; не образуют сероводород на средах с хлоридом железа; обычно не утилизируют цитрат, малонат: не имеют фенилаланиндезаминазы, уреазы, желатиназы: утилизируют ацетат, дают положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную Фогес-Проскауэра; постоянно имеют лизиндекарбоксилазу и не постоянно - орнитиндекарбоксилазу и аргининдегидролазу. Не растут в средах с КСN. По первым шести тестам, указанным в приложении 18 к настоящей Инструкции можно определить принадлежность выделенной культуры к E. сoli.

По морфологическим, ферментативным и культуральным свойствам патогенные и непатогенные кишечные палочки не отличаются друг от друга, их дифференцировка основана на различиях в структуре антигена. Антигенная структура E. сoli весьма сложная. Для построения антигенно-диагностических схем и серологической идентификации, наиболее важное значение имеют липополисахаридные (О-), жгутиковые белковые (Н-), капсульные полисахаридные (К-) антигены.

У эшерихий известно более 170 вариантов О-антигена, более 100 разновидностей К-антигена и около 60 разновидностей Н-антигена. О-антиген термостабилен, Н-антиген - термолабилен. К-антиген по чувствительности к прогреванию подразделяется на 3 типа: А, В и L. При проведении серологических исследований для определения О-антигена необходимо иметь в виду своеобразие О-агглютинабельности, которое у штаммов, содержащих К-антиген, обычно обнаруживается после прогревания, когда разрушаются поверхностные антигены. Этот феномен получил название О-инагглютинабельности.

L и В антигены термолабильны. Прогревание при 100⁰С в течение 1 часа приводит к полной инактивации L-антигена и бактерии, содержащие такой антиген, хорошо агглютинируются О-сывороткой, не агглютинируются соответствующей L-сывороткой и не способны связывать L-антитела. Аналогичная обработка эщерихий, имеющих В-антиген, также делает бактерии агглютинабильными в О-сыворотке, но не лишает способности связывать соответствующие В-антитела и в отдельных случаях агглютинироваться В-сывороткой.

А-антиген термостабилен. Агглютинабильность бактерий, обладающих А-антигеном в О-сыворотке достигается только лишь после прогревания их при 120⁰С в течение 2,5 часов.

У человека кишечная палочка вызывает кишечные инфекции, поражения мочевыводящих путей, бактериемии, менингиты и др.

Этиологической причиной пищевых отравлений из числа E. сoli обычно бывают разновидности, являющие возбудителями энтеральных эшерихиозов.

E.сoli, вызывающие диарею, разделяют на пять типов: энтеротоксигенные E.сoli, ЕТКП - возбудители диареи путешественников, холероподобной диареи у детей и взрослых; энтероинвазивные E. сoli, ЕИКП - возбудители поражений, напоминающие бактериальную дизентерию; энтеропатогенные E. сoli, ЕПКП - основные возбудители диарей у детей 1-го года жизни; энтерогеморрагические E. сoli, ЕГКП - возбудители геморрагического колита и гемолитико- уремического синдрома (наиболее частыми возбудителями бывают серовары О157:Н7 и О26:Н11); энтероагрегирующие E.сoli, ЕАКП – возбудители диарей у детей. Серовары E. сoli наиболее часто вызывающие кишечные инфекции, согласно приложению 19 к настоящей Инструкции. Кроме перечисленных в приложении сероваров возбудителями кишечных инфекций могут быть эшерихии других серологических групп. Антигенно-диагностическая схема сероваров E.сoli, наиболее часто вызывающих кишечные инфекции прдставлена в приложении 20 к настоящей Инструкции.

Критерии диагностики. Возникновение пищевого отравления, вызванного эшерихиями, обычно связано с массивной контаминацией продуктов. В связи с этим значение имеет количественное определение степени обсемененности продуктов этими бактериями.

В случае выделения штаммов эшерихий, подозрительных как возбудителей заболевания, необходимо установить идентичность культур выделенных из разных материалов (пищевые продукты, смывы, рвотные массы, промывные воды и др.) по морфологическим, ферментативным, культуральным свойствам и расшифровать их антигенную структуру. В целях установления эпидемических связей используется определение сероваров.

Бактериологическое исследование клинического материала.

Первый день. Испражнения засевают на среду (Эндо, ЭМС) таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний (готовят ряд разведений в изотоническом растворе хлорида натрия). Жидкие материалы засевают без разведения. Инкубируют в течение 18-20 ч. при 37⁰С.

Второй день. Изучают колонии выросшие на средах Эндо, ЭМС. При наличии только однотипных колоний для дальнейшего исследования намечают 10 колоний. При обнаружении 2-3 и более видов колоний намечают 3-5 колоний каждого вида. Поиск и первичный отбор колоний выросших на чашках первичного посева, проводят серологическим методом в реакции агглютинации на стекле с использованием поливалентной сыворотки ОКА. Оставшуюся часть колоний, давшей положительную реакцию с сывороткой ОКА, отсевают на скошенный агар и на одну из комбинированных сред для первичной идентификации.

Третий день. Культуры «подозрительные» на принадлежность к роду Escherichia (по данным комбинированной среды) повторно проверяют в реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой ОКА и при положительном результате испытывают с поливалентными сыворотками (ОКБ, ОКС, ОКД, ОКЕ) или ОК – иммуноглобулинами. При наличии положительной реакции культуры засевают со скошенного агара в питательные среды для воспроизведения тестов минимального дифференцирующего ряда, необходимых для подтверждения принадлежности культуры к роду Escherichia согласно приложению 4 к настоящей Инструкции.

Четвертый день. При подтверждении принадлежности бактерий к эшерихиям проводят испытание в агглютинационном тесте на стекле с моновалентными ОК – сыворотками или иммуноглобулинами, входящими в поливалентную сыворотку, давшую положительную реакцию (живая культура), и определяют в агглютинационном тесте на стекле О-антиген с адсорбированными групповыми и факторными О-сыворотки (культура, прогретая 30 мин при 100⁰С), если таковые имеются. При наличии положительного результата реакции агглютинации с живыми и подогретыми культурами обозначают ОК группу изучаемого штамма в соответствии с использованными диагностическими препаратами. При отсутствии ОК – иммуноглобулинов и адсорбированных О – сывороток подтверждают принадлежность культур к соответствующей ОК – группе в пробирочном агглютинационном тесте с возрастающими разведениями ОК-сыворотки до ее О-титра, указанного на этикетке, в двух рядах пробирок (живая и подогретая 1 ч при 100⁰С). Учет результатов осуществляют через 18-20 ч инкубируют при 37⁰С.

Пересев культуры с установленной или ориентировочно определенной ОК – группой на глицериновый агар, скошенный в пробирке для типирования бактерий по Н – антигену в аглютинационном тесте на стекле (при наличии соответствующих диагностических прапаратов). Инкубация 18-20 ч при 37⁰С.

Пятый день. Обозначение ОК-группы эшерихий при наличии положительного результата в соответствующей сыворотке: агглютинация до титра или половины титра К-антител ( с живыми бактериями) и О- антител (с прогретыми бактериями). Серологическое типирование по Н- антигену культуры (с глицеринового агара) в агглютинационном тесте на стекле вначале в поливалентных, затем в моновалентных Н – сыворотках (входящих в соответствующую поливалентную, с которой реагировала культура). По совокупности определенных разновидостей О-, К- и Н- антигенов устанавливают серовар штамма эшерихий.

При определении Н- антигена методом иммобилизации из пробирки с положительным результатом в поливалентной Н- сыворотке (рост бактерий только по ходу укола) производят посев культуры в пробирки, содержащие полужидкий агар и моновалентные Н- сыворотки, соответствующие поливалентной, давшей положительный результат иммобилизации. Инкубируют 18-20 ч при 37⁰С.

Шестой день. Учет иммобилизации культуры и при положительном результате обозначение соответствующего Н-антигена. По совокупности установленных разновидностей О-, К-, Н- антигенов определение серовара штамма эшерихий.

Исследование пищевых продуктов.

Для получения количественных показателей обсемененности продукта, из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений так, чтобы можно было определить в 1 г (см³) продукта количество E. сoli. По 0,1 или 0,2 см³ навески продукт или его разведения наносят на поверхность двух параллельных чашек Петри со средой Эндо.

Для выявления E. сoli в определенной навеске продукта навеску или его эквивалентное разведение вносят в среду Кесслера. Соотношение между количеством высеваемого прдукта, или его разведением и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации 1:1. Посевы на агаризованных и жидких средах инкубируют при 37⁰С в течение 24-48 ч. Посевы просматривают через 24 ч, отмечают положительные посевы в жидкие среды, окончательный учет проводят через 48 ч. Положительными считаются посевы в жидкие среды, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкисления среды (изменении цвета среды). Для подтверждения принадлежности микроорганизмов выросших на жидких средах к E. сoli производят пересевы на поверхность среды Эндо. Инкубируют при 37⁰С 24-48 ч. Посевы на агаризованных средах просматривают, отмечают рост характерных колоний, принадлежность выросших колоний к E. сoli проводят как описано выше при исследовании клинического материала, отбирают не менее чем 5 колоний, если при подтверждении характерных колоний в 80 % случаев, т.е. не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост E. сoli, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри принадлежат к E. сoli. В остальных случаях количество E. сoli определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения. Пересчитывают их количество на 1г (см³) исследуемого материала, общепринятым способом.

ГЛАВА 6

БАКТЕРИИ РОДА PROTEUS

Бактерии рода Proteus относятся к семейству Enterobacteriaсeae. Род состоит из 4 видов: P.mirabilis, P.myofaciens, P.penneri, P.vulgaris. Чаще вызывают заболевания у человека - P.mirabilis, P.vulgaris.

Род образуют прямые палочки с закругленными концами размером 0,4-0,8х1-3 мкм, грамотрицательные, бескапсульные, подвижные (перитрихи, подвижность более выражена при 20-22⁰С).Многие роятся, образуя ползучие колонии с отростками. Оксидазоотрицательные, каталазоположительные, реакция с метиловым красным положительная. По образованию индола, реакции Фогес-Проскауэра и пробе на среде Симмонса с цитратом виды различаются. Лизиндекарбоксилаза и аргининдигидролаза отсутствуют. Декарбоксилировать орнитин способен только Р.mirabilis. Осуществляют окислительное дэзаминирования фенилаланина и триптофана, гидролизуют мочевину. Разлагают тирозин, растут в прсутствии KCN, обычно образуют H₂S, малонат не используют. Биохимические свойства представлены в приложении 21 к настоящей Инструкции.

В практических лабораториях для определения принадлежности выделенных бактерий к роду Proteus достаточно использовать ограниченное число тестов.

Протеи растут на простых питательных средах, температурный оптимум 35-37⁰С, оптимум рН 7,2-7,4. Рост бактерий сопровождается появлением гнилостного запаха. На твердых средах жгутиковые (Н-) формы характеризуются сплошным ростом. При посеве бляшкой бактерии дают феномен «роения». На среде Плоскирева формируют крупные (d 2-3 мм) полупразрачные изолированные колонии правильных очертаний, слегка выпуклые с желтовато-розовым оттенком (в зоне роста среда подщелачивается и желтеет). На висмут-сульфит агаре через 48 ч образуют серо-коричневые колонии (с черно-коричневой зоной под ними), на агаре Эндо формируют бесцветные колонии. Вызывают помутнение жидких питательных сред.

Антигенная структура. У протеев обнаружены О-, Н-, К-, антигены. Диагностическое значение имеют: соматический О-антиген и жгутиковый Н-антиген. О-антиген расположен в бактериальной клеточной стенке и представляет собой полисахаридно-липидно-белковый комплекс. Серологическую специфичность О-антигена определяет его полисахарид. О-антиген обладает термостабильностью. Термолабильный Н-антиген является белковым соединением и содержится в жгутиках.

Серовар бактерий рода Proteus устанавливается по сочетанию О- и Н-антигенов с учетом их факторного состава.

Критерии диагностики. Доказательством этиологической роли протея является массивное обнаружение этого микроба в пищевых продуктах, в испражнениях (10⁶ и более в 1г.) при наличии клинических симптомов заболевания, в рвотных массах.

Бактериологические исследования.

Первый день. Для количественного учета и получения чистой культуры первичный посев исследуемого материала производят по 0,1 мл из десятикратных разведений в 0,1% стерильной пептонной воде, до разведения 10^-6 в конденсационную воду свежескошенного мясо-пептонного агара по методу Шукевича и на поверхность питательных сред (Плоскирева, висмут – сульфит агар)

Посевы помещают в термостат при температуре 37⁰С на 18-24 часа.

Второй день. Просматривают посевы на скошенном мясо-пептонном агаре. Если регистрируют ползучий нежный вуалеобразный рост, то определяют титр по наименьшему количеству засеянного материала, в котором обнаружен рост бактерий рода Proteus.

После инкубации в течение 18-24 часов в термостате при 37⁰С чашки с посевами просматривают и отмечают характерные колонии, подлежащие дальнейшему исследованию. Наличие на среде Эндо или ЭМС, при выявлении других представителей семейства Enterobacteriaсeae, ползучего роста дает основание определить в исследуемом материале бактерии рода Proteus. Для биохимического и серологического типирования необходимо изучение отдельных изолированных колоний. Для получения изолированных колоний со среды Эндо или ЭМС делается пересев в пробирки с бульоном и после 4-5 часовой инкубации при 37⁰С повторный пересев на слабщелочной агар с 0,4% карболовой кислотой, или среду Плоскирева, SS-агар, висмут-сульфит агар. На следующий день изолированные колонии подвергаются дальнейшему изучению по обычной схеме.

Если рост 18-24-часовой культуры однородный, то для дальнейшего изучения используют не менее трех колоний, при росте разных колоний для их изучения надо брать больше колоний, различных по внешнему виду.

Для определения родовой принадлежности изучаемого штамма изолированные колонии отсевают в пробирку с мясопептонным бульоном, из которого после 4-5-часовой инкубации при 37⁰С производят пересевы на следующие среды: бульон или пептонную воду для определения индола, среду с мочевиной для определения фермента уреазы, агар Клиглера для определения ферментации глюкозы и образования сероводорода, 6 или 10% лактозу, 0,5% мальтозу, 0,3% полужидкий агар для определения подвижности; скошенный слабощелочной агар для серологического типирования.

Третий и четвертый дни. Учитывают результаты ферментативной активности культур, выделенных накануне. Грамотрицательные культуры, ферментирующие глюкозу, гидролизующие мочевину, образующие сероводород и не ферментирующие лактозу, оценивают как бактерии, принадлежащие к роду Proteus. На основании способности к индолообразованию и ферментации мальтозы определяют принадлежность к одному из видов: штаммы, ферментирующие мальтозу и образующие индол, относят к Proteus vulgaris; штаммы, не ферментирующие мальтозу и не образующие индол, к Proteus mirabilis. При необходимости более углубленного изучения ферментативных свойств выделенную культуру изучают по всем тестам, согласно приложению 21 к настоящей Инструкции.

Если изучаемый штамм продуцирует индол и сероводород, не ферментирует (или ферментирует) лактозу и не расщепляет мочевину, необходимо произвести дифференциацию между редко встречающимися видами рода Proteus, не гидролизующими мочевину или ферментирующими лактозу, и индолположительными вариантами Salmonella и Citrobacter.

Такие штаммы следует в первую очередь проверить на наличие фенилаланиндезаминазы. Для определения фенилаланиндезаминазы производят посев в пробирки со скошенным агаром, содержащим фенилаланин. Через 18-24 часа инкубации при 37⁰С на поверхность среды с ростом наслаивают 10% хлорное железо (FeCl)₃). Появление интенсивной зеленой окраски свидетельствует о положительной реакции. Штаммы, дезаминирующие фенилаланин, относятся к роду Proteus. Штаммы, не образующие фенилаланиндезаминазу, подвергают дальнейшему изучению для определения их принадлежности к другим родам семейства Enterobacteriaceae.

Серологическое типирование. Штаммы, отнесенные на основании биохимических свойств к роду Proteus, подвергают серологическому типированию.

Определение сероваров возможно у P.vulgaris и P.mirabilis при помощи специфических О- и Н- сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигенно-диагностической схемой этих бактерий (в схеме представлены 49 серологических О-групп и 19 Н-антигенов) согласно приложению 22 к настоящей Инструкции и «Наставлениям по применению агглютинирующих протейных О- и Н- сывороток. Для реакции агглютинации используют суточную культуру на слабощелочным питательным агаре, которую испытывают вначале с поливалентными, а затем при положительной реакции агглютинации с моновалентными О-сыворотками, входящими в поливалентную. После установления О-группы определяют Н-антиген, применяя вначале поливалентные, а затем моновалентные Н-сыворотки.

При отсутствии диагностических Н-сывороток и необходимости решить вопрос однородны ли по Н-антигену выделенные штаммы (например, при определении источника инфекции в очаге) может быть использован феномен Диенеса. Для выявления феномена Диенеса чашку Петри с 2% слабощелочным питательным агаром делят пополам, на каждую половину среды (на полюсах диаметра чашки) засевают по 1 капле 4-5 часовой бульонной культуры, инкубируют при 37⁰С 18-20 ч. При наличии двух идентичных по Н-антигену штаммов отмечают слияние зон роста в результате «роения»; при различных Н-антигенах между обеими участками образуется разграничительная зона шириной 0,5-2 мм.

Разработаны антигенно-диагностические схемы других видов рода Proteus, Providencia и Morganella, но отсутствуют производственные диагностические сыворотки. В качестве эпидемических маркеров используют определение биоваров и чувствительность к антибиотикам. Дифференциация Providencia rettgeri на биовары согласно приложению 23 к настоящей Инструкции, дифференциация Providencia alcalifaciens и Providencia stuartii согласно приложению к 24 настоящей Инструкции.