Инструкция 10-15-21-2006 микробиологические методы выделения и идентификации возбудителей

ENTEROCOCCUS

E. faecalis и E. faecium чаще других являются этиологическими факторами пищевых отравлений.

Энтерококки - овальные или сферические бактерии размером 0,6-2,0 х 0,6-2,5 мкм. В мазках из жидких сред располагаются парами или в виде коротких и длинных цепочек, из плотных - в виде диплококков или скоплений кокков, грамположительны. Спор и капсул не образуют. Как правило, не подвижны, иногда подвижны за счет 1-4 жгутиков. Резко полиморфны. Полиморфизм особенно выражен у культур, выделенных из пищевых продуктов. Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, метаболизм бродильного типа, каталазоотрицательные.

По антигенному строению энтерококки составляют однородную группу, обозначаемую по серологической классификации Лансфилд буквой D. У E.faecalis отмечено наличие видового антигена, который по своей химической природе является термоустойчивым полисахаридом.

Энтерококки довольно медленно растут на обычных питательных средах, для более интенсивного роста в среды добавляют углеводы (глюкозу, лактозу), многоатомный спирт - маннит, дрожжевые препараты (автолизаты. диализаты, экстракты), аминокислоты (агринин, аланин и др.), витамины (рибофлавин, никотиновая кислота и др.). Энтерококки хорошо растут на кровяном и шоколадном агаре.

На плотных питательных средах энтерококки образуют мелкие круглые колонии. При росте в жидких средах они вызывают их диффузное помутнение и образование аморфного осадка.

Критерии Шермена - признаки четко дефференцирующие энтерококки от стрептококков. Они растут при температуре от 10⁰С до 50⁰С (оптимальная температура 37⁰С), при рН 9,6, концентрации NaCl 6,5 % и желчи - 40 %, растут в молоке с 0,1% метиленового синего (обесцвечивание).

Основные виды энтерококков вызывающих пищевые отравления, отличаются по ряду признаков, согласно приложению 29 к настоящей Инструкции.

Свежевыделенные из любого источника штаммы энтерококков, обладающие протеолитическими свойствами, проявляют свои энтеропатогенные свойства, если попадают в организм людей в количествах, составляющих 10⁶ и более живых клеток в 1 г (см³) продукта.

Энтерококки являются облигатными представителями нормальной микрофлоры кишечника человека и теплокровных животных (у здоровых людей количество энтерококка в 1 г испражнений колеблется в пределах 10⁴-10⁹) в связи, с чем они широко распространены во внешней среде, в различных пищевых продуктах, но особенно часто их обнаруживают в молочных продуктах. Органолептика продуктов зависит от вида энтерококка, обсеменяющего продукт. Так, штаммы E.faecium не изменяют органолептику мясных продуктов, а молоко свертывают и придают ему приятный вкус кисломолочного продукта. Штаммы энтерококков, которые могут вызывать пищевые отравления, придают продуктам неприятный горький вкус и ослизнение, но органолептические изменения в продуктах наступают, когда в них содержится более чем 10⁶ клеток энтерококков в 1 г (см³). Протеолитические вариатны E.faecalis могут вызывать пищевые отравления, симптомами которых являются жидкий стул до 3-5 раз в сутки, боли в животе при нормальной температуре тела.

При лабораторной диагностике энтерококковых пищевых отравлений исследованию следует подвергать продукты, заподозренные как факторы передачи, испражнения, рвотные массы и промывные воды желудка.

Критерии диагностики. Диагноз энтерококкового пищевого отравления подтверждается, если в продукте и кале больных были обнаружены протеолитические штаммы энтерококков в количествах более чем 10⁶ в 1 г (см³) продукта и более чем 10⁴ в грамме кала при наличии клинических симптомов заболевания.

Бактериологические исследования клинического материала.

Первый день. Рвотные массы и промывные воды желудка перед посевом нейтрализуют 10% раствором двууглекислого натрия до рН 7,2-7,4. Испражнения суспендируют в ИХН 1:10, затем готовят десятикратные разведения до 10^-5 на 0,1% пептонной воде. Из каждого разведения берут по 0,1 мл и высевают на энтерококковую дифференциально-диагностическую среду (далее - ЭДДС). Высеянный материал тщательно втирают шпателем в поверхность среды. Посевы инкубируют при 37⁰C в течение 24-48 часов.

Второй день. Через 18-24 часа посевы просматривают, обращают внимание на количественную обсемененность и видовую принадлежность выделенных энтерококков. На среде ЭДДС все энтерококки растут хорошо, гемолитически активные штаммы образуют вокруг колоний белые зоны, соответствующие цвету молочного агара, или зоны позеленения среды, у протеолитически активных штаммов появляются четко выраженные темно-красные или бурые зоны вокруг колоний, при наличии обоих (гемолитического и протеолитического) фермента среда вокруг колоний просветляется, приобретая вид обычного питательного агара, штаммы энтерококков не продуцирующих этих ферментов цвет не изменяют. Учитывают способность исследуемых культур к редукции 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ). E. faecalis растут в виде вишнево-красных колоний с белыми ободками, колонии E. faecium бесцветны, или окрашены в слабо-розовый цвет. Подвижные формы энтерококков, обладая слабой редуцирующей активностью, образуют карликовые колонии розовых оттенков разной интенсивности. 3-5 колоний отсевают на скошенный агар для дальнейшей идентификации. На скошенном агаре посевы культивируют при 37⁰C в течение 24 часов.

Третий день. Из роста на скошенном агаре готовят мазки и красят их по Граму. Определяют каталазную активность штаммов. Грамположительные, каталазоотрицательные диплококки подвергают дальнейшему изучению.

Культуры высевают на желчно-щелочной агар (далееЖЩА), сахарно-дрожжевой агар с теллуритом калия, в столбик 0,2 % агара. Окончательно учитывают протеолитическую активность.

Подсчитывают все типичные колонии и число их пересчитывают на 1 г/мл исследуемого материала.

Четвертый день. Учитывают результаты третьего дня. Рост культуры на ЖЩА подтверждает ее принадлежность к энтерококкам. На сахарно-дрожжевом агаре с теллуритом калия растут только штаммы вида E. faecalis, устойчивые к высоким концентрациям теллурита калия. В процессе роста они восстанавливают теллурит калия, образуя при этом черные колонии, окруженные узким бесцветным ободком. В полужидком (0,2 %) агаре, засеянным уколом, подвижные формы энтерококков вызывают диффузное помутнение всего столбика среды, неподвижные виды растут только по ходу укола.

Пищевые продукты. Для определения количества энтерококков, 0,1 или 0,2 см³ продукта или его разведения, высевают на поверхность питательной среды (ЭДДС, канамицин-эскулин-азидный агар и др.). Посевы инкубируют при 37⁰C через 24 ч проводят предварительный, через 48 ч окончательный учет результатов. На канамицин-эскулин-азидном агаре колонии энтерококков оливково-зеленые, до темно-коричнево-черных, с равномерной окраской поля. Учитывают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний.

3-5 колоний отсевают на скошенный агар для дальнейшей идентификации, посевы культивируют при 37⁰C в течение 24 часов.

Из роста на скошенном агаре готовят мазки и красят их по Граму. Определяют каталазную активность штаммов. Дальнейшую идентификацию проводят, как описано выше. Если при подтверждении характерных колоний в 80 % случаев, т.е. не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост энтерококков, то считают, что все колонии принадлежат к энтерококкам. В остальных случаях количество энтерококков определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству колоний, взятых для подтверждения. Результаты пересчитывают на 1 г (см³) продукта.

ГЛАВА 11

CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Возбудители ботулизма широко распространены в природе, нормальные обитатели кишечника животных и человека, попадают в почву с фекалиями. Естественный резервуар-почва. Широкое распространение возбудителей ботулизма в почве ведет к попаданию этих микробов на овощи и фрукты, а также к обсеменению сырья, идущего для приготовления консервов, колбас и других продуктов.

Серологическая идентификация C.botulinum основана на выявлении экзотоксинов. В зависимости от антигенных свойств которых разделяют на 7 сероваров: А, В, С, D, E, F, G. Оптимальная температура для токсинообразования вариабельна: для бактерий типов А, В, С, D - 35°С, для типов Е и F - 28- 30°С. Патогенность C. botulinum для разных теплокровных различна. Заболевания у человека вызыввют бактерии типов А, В, Е, F; бактерии типов С, D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана. Главные факторы патогенности C.botulinum – экзотоксины, оказывают нейротоксическое действие на организм, в организме возбудитель практически не размножается. Ботулинические токсины довольно устойчивы к температурным воздействиям. Токсин иногда разрушается только при кипячении в течение 10-15 минут и не разрушается в желудочно-кишечном тракте под влиянием пищеварительных ферментов. Ботулинический токсин – самый сильный из всех биологических ядов.

C.botulinum типов А, В, С, D, E, F - очень близки по морфологии, культуральным свойствам и по действию их токсинов на организм человека и животных. Все они дают одинаковую клиническую картину болезни. Различные типы ботулинического микроба отличаются по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов, токсин каждого типа нейтрализуется сывороткой того же типа.

По морфологии возбудители ботулизма представляют собой небольшие палочки 0,6-1,0 х 3,0-9,0 мкм с закругленными концами. Палочки образуют субтерминальные или терминальные споры, палочки со спорой имеют вид теннисной ракетки, легко окрашиваются различными анилиновыми красками, молодые клетки грамположительны, при старении культуры (через 4-5 суток роста) палочки окрашиваются грамотрицательно, микробы подвижны, имеют от 4 до 35 жгутиков, капсул не образуют.

Возбудители ботулизма - строгие анаэробы, они растут без доступа воздуха, поэтому обычно размножаются и образуют токсин внутри больших кусков рыбы, ветчины, колбасы, либо в герметически закрытых банках консервов. Возбудители ботулизма типа Е, а также непротеолитические штаммы типа В и некоторые штаммы типа F образуют на питательных средах и в пищевых продуктах кроме токсина и нетоксичный предшественник токсина - протоксин, который, не убивая мышей при парентеральном введении, проявляет свою биологическую активность при попадании в желудочно-кишечный тракт человека и животных в результате воздействия на него протеолитических ферментов.

При добавлении протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина) in vitro также происходит активация протоксина, который переходит в токсин. Этот феномен следует учитывать при проведении лабораторной диагностики ботулизма.

Нередко консервные банки, куда вместе с продуктами попадает и возбудитель ботулизма, оказываются бомбажными за счет образования микробом газа, однако, часто при нали­чии микробов ботулизма и ботулинических токсинов пищевые продукты выглядят совершенно доброкачественными и консервные банки не дают «бомбажа». Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла.

Критерии диагностики. Лабораторная диагностика ботулизма преследует цель обнаружения и идентификации ботулинического токсина и выделение возбудителя. Лабораторному исследованию подлежат остатки пищевых продуктов, материал полученный от больного (кровь, испражнения, моча, промывные воды желудка, рвотные массы) и секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5-10 мл, промывные воды желудка забирают в объеме 50-100 мл, кал 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде. Кровь исследуют только на наличие токсина (для чего проводят биологическую пробу), испражнения только на наличие возбудителя (проводят посев на питательные среды), весь остальной материал на наличие возбудителя и его токсина.

Бактериологические исследования.

Обнаружение и идентификация токсина.

Первый день. Пробы исследуют одновременно по двум направлениям: производят обнаружение ботулинических токсинов и ботулинических микробов. Две трети, предварительно подготовленной пробы используют для обнаружения ботулинических токсинов, одну треть - для посевов с целью обнаружения ботулинических микробов.

Часть пробы, которую исследуют на наличие токсинов, выдерживают в течение 1-1,5 часов при комнатной температуре для экстрагирования токсинов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 2500-3000 об/мин, в течение 15-20 минут.

Для обнаружения ботулинических токсинов с полученными фильтратами или надосадочной жидкостью ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксической сывороткой и реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с диагностикумом эритроцитарным ботулиническим поливалентным типов АВЕ иммуноглобулиновым сухим и диагностикумом эритроцитарным ботулиническим моноспецифическим А, В, и Е иммуноглобулиновым сухим.

Обнаружение ботулинических токсинов в реакции нейтрализации.

Для обнаружения токсинов следует взять для каждой пробы 4-х мышей весом 16-18 грамм. В связи с тем, что в исследуемом материале может быть один или несколько типов ботулинических токсинов, предварительную реакцию необходимо ставить со смесью противоботулиничеоких диагностических сывороток типа А, В, С, Е, F. С этой целью выпускаются сухие типоспецифические диагностические сыворотки, титр которых должен быть в пределах: для типа А - 200-400 ME; для типа В - 100-200 ME; для типа С - 200-300 ME; для типа Е - 200-400 ME; для типа F - 50-100 ME.

Доза сыворотки, которую рекомендуют для реакции нейтрализации, как правило, обеспечивает нейтрализацию гомологичного токсина в исследуемой пробе, ибо в организме и выделениях больных, а также в экстрактах из пищевых продуктов, очень сильные токсины почти не встречаются.

Нельзя пользоваться для целей диагностики лечебными противоботулиническими сыворотками.

Для постановки реакции нейтрализации готовят смесь из равных объемов моновалентных сывороток типов А, В, С, Е, F. Типовой протокол развернутой реакции нейтрализации согласно приложению 26 к настоящей Инструкции. Из каждой исследуемой пробы наливают в две пробирки равное количество (1,5-2,4 мл) фильтрата или надосадочной жидкости. Остаток сохраняют в холодильнике для дальнейших исследований. В одну пробирку (контроль) добавляют 0,6 мл физиологического раствора, в другую (опыт)- 0,6 мл смеси моновалентных сывороток.

Содержимое пробирок перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут, после чего содержимое каждой пробирки вводят в объеме 0,7-1,0 мл двум белым мышам. Исследуемый материал из каждой пробирки следует вводить разными шприцами или сначала контроль, а затем опыт.

Наблюдение за животными проводят в течение 4-х дней, однако, если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставят реакцию нейтрализации с моновалент­ными сыворотками. Ботулинический токсин не дает молниеносной гибели животных (в течение нескольких минут или секунд), мыши погибают не ранее, чем через 4-5 часов.

При наличии ботулинического токсина погибают две мы­ши контрольные, которым вводили несмешанный с сыворотками фильтрат, опытные мыши остаются живы.

Обычно картина болезни и гибели мышей очень характерна: появляется учащенное дыхание, состояние полного расслабления мышц, западение брюшной стенки («осиная талия»), параличи и судороги перед смертью.

В случае гибели всех 4-х мышей, т. е. тех, которым был введен фильтрат без сыворотки и с сывороткой, следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз. При разведении экстрактов посторонняя микрофлора теряет способность убивать мышей, а ботулинические токсины, обладая обычно большей биологической активностью, будут вызывать гибель мышей даже при разведении фильтров (экстрактов).

Вместо мышей для реакции нейтрализации могут быть использованы морские свинки весом 250-300 г. Одной из них вводят подкожно или внутрибрюшинно 0,5 мл смеси сывороток А, В, С, Е, F и 3 мл испытуемого фильтрата (или надосадочной жидкости), контрольной свинке вводят 3 мл испытуемого материала.

В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина сразу же ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками.

В 6 пробирок разливают по 2,4 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа А, во вторую - типа В, в третью - типа С, в четвертую - типа Е, в пятую - типа F, в шестую приливают 0,6 мл физиологического раствора. Все сыворотки наливают разными пипетками. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 1 мл двум мышам из каждой пробирки отдельными шприцами, типовой протокол развернутой реакции нейтрализации согласно приложению 30 к настоящей Инструкции.

Учет результатов проводится через 4-6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4-х дней. При наличии ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.

Например, если гибнут все мыши, кроме тех, которым введено содержимое пробирки № 1, то в исследуемом мате­риале будет установлен токсин типа А.

Особое внимание нужно обратить на постановку реакции нейтрализации с сывороткой больного, так как ее обычно бывает мало. Следует сразу поставить развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными ботулиническими сыворотками только типов А, В, Е, т.к. остальные типы ботулинических палочек встречаются очень редко. Для этого в три пробирки поровну разливают всю сыворотку больного, а затем в первую пробирку добавляют диагностическую сыворотку типа А - 0,4 мл, во вторую - типа В, в третью - типа Е. Все содержимое каждой пробирки вводят поровну двум мышам. Например, если в каждую пробирку налили по 1,8 мл сыворотки больного, а затем по 0,4 мл диагностической сыворотки, всего в пробирке будет 2,2 мл смеси. Эту смесь вводят внутривенно или внутрибрюшинно мышам по 1 мл (0,2 мл останется на стенках пробирки). Выжившие мыши укажут на тип токсина в крови больного, контролем будут павшие мыши, которым была введена сыворотка больного в смеси с диагностической ботулинической сывороткой других типов.

При получении положительной реакции нейтрализации с диагностическими ботулиническими сыворотками дают заключение о наличии в исследуемом материале ботулинического токсина и указывают его тип.

Нередко постановку реакции нейтрализации, как с поливалентной, так и с моновалентной сыворотками приходится повторять из-за неспецифической токсичности посторонней микрофлоры, которая обычно имеется в рвотных массах, кале, органах трупов, поэтому в лучшем случае ответ о наличии токсина в пробе может быть дан на 2-3 день, а о его типовой принадлежности на 3-5 день от начала исследования.

В настоящее время установлено, что противоботулиническая сыворотка типа Е нейтрализует также ботулинический токсин типа F и наоборот. Поэтому при получении положительной реакции нейтрализации одновременно с противоботулиническими сыворотками типа Е и F следует провести дифференциальную диагностику: необходимо определить, относится ли обнаруженный токсин к типу Е или к типу F. Для этого следует поставить реакцию нейтрализации на мышах параллельно с двумя противоботулиническими диагностическими сыворотками типа Е и типа F, разведенными до концентрации 1 МЕ/мл. Удобнее всего для этих целей использовать стандартные противоботулинические сыворотки, выпускаемые ГКИ им. Тарасевича. Для этого в три про­бирки наливают по 2,4 мл испытуемого экстракта, а затем в первую пробирку наливают 0,6 мл диагностической сыворотки типа Е, во вторую- 0,6 мл типа F, разведенных до концентрации I ME/мл, в третью - контрольную - 0,6 мл физиологического раствора. Если мыши погибают только в контроле и с сывороткой типа Е, то в экстракте имеется токсин типа F. Если наряду с контролем погибают мыши, которым введена смесь с сывороткой типа F, а выживают только мыши с сывороткой типа Е, то в экстракте токсин типа Е.

Обнаружение ботулинических токсинов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

Реакция пассивной гемагглютинации (микрометодом) позволяет получить ответ о содержании ботулинических токсинов в воде, воздухе, смывах, продуктах питания, фураже, силосе и.т.д через 3-4 часа. При этом используются диагностикумы эритроцитарные ботулинические моноспецифические типов А, В и Е и поливалентные типов АВЕ иммуноглобулиновые сухие. Эритроцитарные диагностикумы (ЭД) представляют собой лиофилизированные в объеме 1 мл 3 % взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированные антителами (иммуноглобулины класса G) к ботулиническим токсинам типов А, В или Е. Постановка РПГА согласно инструкции по применению.

Обнаружение возбудителей ботулизма.

Первый день. Для обнаружения возбудителей ботулизма производят посев 3-5 мл из 1/3 предварительно подготовленного материала на жидкие питательные среды. Для первичных посевов используют печеночно-глицериновую среду, бульон триптиказо-пептонно-глюкозный с дрожжевым экстрактом и трипсином, бульон Хоттингера, среду Китт-Тароцци, среду питательную для контроля стерильности и др. Необходимо, чтобы рН был в пределах 7,2-7,4. Обязательным является наличие в мясных средах мясного или печеночного фарша, а в казеиновых - отварного пшена и ваты. Пробирка или флакон должны быть заполнены питательной средой не менее чем наполовину. Перед посевом среды нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут, после чего быстро охлаждают, добавляют 0,5% глюко­зы и производят посев.

Посевы необходимо производить в среды в больших пробирках или во флаконах емкостью по 100-200 мл, залитые слоем вазелинового масла толщиной в 0,5 см. Лучше засевать исходный посевной материал в большой объем среды (70,0-150 мл), чтобы культуральной жидкости первичного посева хватило на все исследования (постановка реакции с поливалентной сывороткой и развернутой реакции нейтрализации, нередко с двух или трехкратным повторением). Последующие пересевы исследуемых проб из первичного посева в те же жидкие питательные среды могут не дать токсинообразования в среде, из-за бурного роста посторонней микрофлоры.

Посев производить в четыре флакона, один из которых прогревают после посева при 60⁰С 15 минут. В этих условиях прогревания обычно погибают аэробы и вегетативные формы анаэробов, но сохраняются споры C.botulinum типа Е, которые погибают при 80⁰С; другой флакон прогревают при 80⁰С 20 минут. Два флакона после посева не прогревают. После этого все флаконы помещают в термостат: один непрогретый флакон и флакон, прогретый при 60⁰С, инкубируют при 28⁰С, другой непрогретый флакон и флакон, прогретый при 80°, инкубируют при 35⁰С. Первые два флакона исследуют на C.botulinum, типов Е и F, вторые два флакона на C.botulinum типов А, В, С.

Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост в посевах будет, главным образом, в непрогретых флаконах. В том же случае, если в материале имеются споровые формы, рост будет в прогретых флаконах и в отдельных случаях может сразу привести к выделению чистой культуры из такого посева. Рост C.botulinum, характеризуется нередко сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша.

После посева все исходные образцы проб следует хранить на холоду до окончания исследования. Через 48 часов после появления роста посевы исследуются на наличие возбудителей ботулизма.

Есть сообщение зарубежных ученых о том, что для выявления C.botulinum типа Е в среду перед посевом следует добавлять трипсин до конечной концентрации 0,1%. В опытах этих исследователей процент выявления C.botulinum типа Е из почвы увеличился на среде с трипсином до 74% исследуемых проб, в то время как исследование этих проб на среде без трипсина дало положи­тельный результат лишь в 17% проб.

Так как для таких исследований требуется трипсин в довольно больших количествах, его можно заменить эквивалентным количеством панкреатина. Кроме того, такие среды можно брать в пробирках с объемом среды 15-20 мл. Трипсин следует готовить в виде 1% раствора, стерилизовать путем фильтрации через асбестовые стерилизующие пластины фильтра Зейтца и добавить из расчета 1 мл 1%-го раствора трипсина на 10 мл среды во флаконы, которые будут инкубироваться при 28⁰С. В тот флакон, который предварительно прогревается, трипсин добавить после прогревания.

Второй день. Через 48 часов от начала роста из всех флаконов с соблюдением стерильности берут пробы культуральной жидкости (по 10-15 мл) и подвергают их исследованию. Предварительно готовят мазки, красят их по Граму и микроскопируют.

С культуральной жидкостью ставят реакцию нейтрализации с поливалентной противоботулинической сывороткой типов А, В, С, Е, F, как это описано для определения токсинов. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно.

При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типич­ных по морфологии для C.botulinum, а также ботулинического токсина дают заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма и наличии в нем ботулотоксина. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.

Если в посевах обнаруживают микробы, по морфологии сходные с C.botulinum, а токсин отсутствует, то следует перед постановкой реакции нейтрализации провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином для обнаружения ботулинических токсинов типа Е, непротеолитичных штаммов типа В и некоторых штаммов типа F, а также провести выделение и изучение чистых культур. Активацию культуральной жидкости перед постановкой реакции нейтрализации с противоботулиническими сыворотками проводят только в том случае, если в среду перед посевом не был добавлен трипсин или панкреатин, как это рекомендовано выше.

Если через двое суток во флаконах не обнаружен рост, то необходимо продолжить инкубацию посевов в термостате, а исследование провести вновь на 4-6-10 сутки. Если исследования, проведенные на 10 сутки, не дали положительных результатов по обнаружению возбудителей ботулизма и их токсинов, то выдают ответ об отсутствии ботулинических палочек и их токсинов в исследуемых материалах.

Посев в высокий столбик агара.

Для выделения чистых культур ботулинических палочек применяют 1-1,5% агар с глюкозой, приготовленный на бульоне Мартена или бульоне Хоттингера, разлитый в пробирки диаметром 0,8 см и длиной 15-18 см. Перед посевом агар расплавляют и охлаждают до 45-50⁰С. Посев на высокий столбик производят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают ее в исследуемый материал (чаще это первичный посев материала исследуемого) и переносят последовательно из пробирки в пробирку, тщательно перемешивая, после чего агар перемешивается еще раз путем перекатывания пробирок между двумя ладонями. Охлажденные пробирки с посевом помещаются в термостат при температуре 35-37⁰С. На каждый посев следует брать 5-8 пробирок столбика агара. Если в первичном посеве имеется массивный рост посторонней микрофлоры и мало типичных ботулинических палочек со спорами, необходимо взять 5-10 мл культуры в пробирку и подвергнуть ее прогреванию на водяной бане при 80⁰С 20 минут. После этого культуру надо снова посеять на высокий столбик агара.

Через 1-2 суток в последних пробирках появляются отдельные колонии в виде комочков ваты, пушинок с уплотненным центром или же правильных дисков, чечевичек. Подозрительные колонии пересевают на жидкую или полужидкую питательную среду в пробирках с 0,5% глюкозы под слоем вазелинового масла. Одновременно оставшуюся часть колонии микроскопируют.

Пересев колоний из пробирок можно производить двумя способами: столбик агара прокалывают сверху отломанным капилляром пастеровской пипетки и извлекают нужную колонию; дно пробирки с высоким столбиком агара слегка подогревают на пламени горелки; под действием паров закипевшей жидкости агар выталкивается в стерильную чашку Петри. Подозрительную колонию извлекают отломанным капилляром пастеровской пипетки.

Культуру, выросшую из колонии в жидкой среде, микроскопируют и проверяют на наличие токсина с помощью реакции нейтрализации на мышах.

Посев на чашки.

Каплю исследуемой жидкости наносят на поверхность сахарно-кровяного или печеночного агара, разлитого толстым слоем (приблизительно 3-5 мм) в чашки Петри. Затем каплю шпателем слегка втирают в агар и последовательно переносят шпатель еще на 2-3 чашки. Чашки помещаются в микроанаэростат крышкой кверху и выращивают при температуре 35-37⁰С.

С целью поддержания достаточного вакуума на дно анаэростата ставится открытая чашка Петри со щелочным раствором пирогаллола. Через сутки колонии ботулинического микроба выглядят в виде прозрачных росинок дымчатого цвета, диаметром 0,1-0,2 см, окруженные зоной гемолиза. Ввиду того, что при большом загрязнении исследуемых проб посторонней микрофлорой возникают трудности в выделении C.botulinum особенно типа Е из-за того, что чувствительность спор этого микроба к нагреванию не отличается от чувствительности вегетативных форм некоторых микробов, рекомендуется простой метод выделения чистой культуры микроба, основанный на устойчивости спор палочки ботулизма к 50% спирту.

К 2 мл культуральной жидкости 2-3-дневной инкубации при 28⁰С, содержащей ботулинический токсин типа Е, добавляют равный объем этилового спирта-ректификата. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, периодически перемешивая, а затем из нее делают высев на 2-3 чашки с печеночным агаром, содержащим желток куриного яйца (желток одного яйца добавляют в 500 мл расплавленного и охлажденного до 50⁰С агара). Через 48 часов инкубации при 35⁰С в анаэростате, среди колоний посторонней микрофлоры, C.botulinum дают небольших размеров колонии, окруженные «жемчужным поясом». Следует отметить, что некоторые спорогенные анаэробы (C.sporogenes и др.) также имеют вокруг колоний «жемчужный пояс». Эти колонии высевают в пробирки со средой Китт-Тароцци, исследуют после инкубации в термостате в реакции нейтрализации. Особенно этот метод рекомендуется для выделения чистой культуры C.botulinum типа Е.

При отсутствии в лаборатории анаэростатов для выращивания анаэробов можно использовать простой чашечный метод, где воздух просто исключается из питательного агара. Метод заключается в следующем: засеянный и слегка охлажденный агар наливается в крышку стерильной чашки Петри, после чего на агар, почти застывший, помещается вторая половина чашки Петри так, чтобы дно ее плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки можно залить парафином. При этом методе поверхность стекла плотно соприкасается с агаром по всей его площади, и в слое агара, находящемся между пластинками стекла, создаются условия, благоприятные для роста самых строгих анаэробов.

Выросшие колонии нужно рассматривать в лупу или в стереоскопический микроскоп. Часть колоний используют для приготовления мазков, которые микроскопируют.

С поверхности чашки колонии снимают петлей или пастеровской пипеткой и засевают в пробирки со средой Китт-Тароцци с 0,5% глюкозы. Выросшие посевы проверяют на чистоту путем микроскопирования и на наличие токсина путем постановки реакции нейтрализации на мышах.

Метод активации прототоксина C.botulinum.

Активацию прототоксинов производят в экстрактах из пищевых продуктов, промывных вод желудка и рвотных масс, а также культуральной жидкости посевов, если исследуемый материал был засеян в среду без трипсина или панкреатина.

Чистый сухой трипсин растворяют перед употреблением в физиологическом растворе в концентрации 1:100 (1%-й раствор); этот раствор принимают за исходный. Для активации берут данный раствор из расчета, чтобы в активируемой культуральной жидкости его концентрация была равна 0,1%.

Трипсин может быть заменен сухим медицинским высокоактивным (активность не должна быть менее 50 единиц) панкреатином, раствор которого готовят следующим образом: 4 г панкреатина растворяют в 100 мл ИХН и оставляют в холодильнике при 4⁰С на 12 ч. Перед употреблением полученную жидкость фильтруют через плотный бумажный фильтр, а затем через стирилизующую пластинку фильтра Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Готовый раствор панкреатина может сохраняться при 4⁰С в течение двух недель.

Исследуемую 4-5-суточную культуру, полученную на жидкой мясной или казеиновой среде, подвергают центрифугированию или фильтрованию с целью отделения микробных тел от культуральной жидкости.

Готовый раствор трипсина добавляют из расчета получения в культуральной жидкости концентрации 0,1%, для чего на 1 мл культуральной жидкости берут 0,1 мл исходного 1 % раствора трипсина.

Если вместо трипсина применяют панкреатин, то культуральную жидкость смешивают в равных пропорциях с готовым раствором панкреатина.

Полученные смеси помещают в термостат при 37⁰С на один час. По истечении указанного срока в активированной жидкости определяют наличие ботулотоксина на белых мышах путем постановки реакции нейтрализации.

Для обнаружения ботулинических токсинов рекомендован ряд других методов, каждый из которых может быть только ориентировочным и должен всегда подтверждаться реакцией нейтрализации на мышах. Это - реакция непрямой гемагглютинации или бентонитовой флокуляции, реакция подавления фагоцитоза, реакция двойной диффузии в геле, люминесцентно-серологический метод для обнаружения возбудителей ботулизма.

Однако, как правило, все перечисленные методы дают положительный результат в руках авторов и только с чистыми штаммами и их токсинами. Эти методы недостаточно специфичны ввиду наличия общих самотических и нетоксичных растворимых антигенов у возбудителей ботулизма и микроорганизмов группы C.sporogenes и C.putrificum. Кроме того, эти реакции не выявляют степени токсичности фильтрата. В силу вышесказанного ни один из указанных методов не применяется, как общепринятый, ни в одной стране. Только биологическая проба на белых мышах в реакции нейтрализации с типоспецифическими противоботулиническими сыворотками является общепринятым методом, метод принят международной ассоциацией микробиологов.