Инструкция 10-15-21-2006 микробиологические методы выделения и идентификации возбудителей

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЯМИ

Наиболее специфичным и чувствитель­ный методом титрования антител является реакция пассивной (непря­мой) гемагглютинации (РПГА). Для постановки РПГА с целью выявления антител к О-антигенам возбудителей брюшного тифа, паратифов, других сальмонеллезов и дизентерии применяют коммерческие стабильные эритроцитарные диагностикумы. При отсутствии эритроцитарных О-диагностикумов, а также для выявления Н-антител применяют реакцию агглюти­нации (типа Видаля) с соответствующими коммерческими О- и Н-диагностикумами. Для серологической диагностики инфекций, вызываемых УПЭ (Esherichia, Yersinia, Citrobacter, Proteus и др.), коммерческие препараты не выпускают, поэтому реакцию агглютинации ставят с аутоштаммами.

При постановке любой из указанных серологических реакций следует учитывать одно принципиально важное обстоятельство, человеческий организм в течение жизни многократно встречается с различными энтеробактериями и их антигенами, поэтому в крови многих практически здоровых людей могут присутствовать (иногда в значительных титрах) антитела к этим антигенам. Вследствие этого понятие «диагностический» титр определяемых антител носит лишь весьма условный ориентировочный характер. Следует учитывать и то, что для разных районов страны (в связи с особенностями эпидемической ситуации и др.) величина «диагностического» титра будет различной. Ее устанавливают в результате титрования сывороток от 100-200 здоровых лиц. Существенно большее диагностическое значение имеет нарастание уровня антител в динамике заболевания, для чего сыворотку нужно брать сразу после выявления больного, а затем в конце первой или в начале второй недели болезни. В более поздние сроки заболевания титр антител к специфическому антигену снижается, что также может служить диагностическим признаком.

Значительную помощь для постановки более обоснованного диагноза оказывает определение не только общего (суммарного) титра антител без дифференциации их на классы иммуноглобулинов, но и антител, относящихся к классу иммуноглобулинов G (IgG). Нормальные (так называемые неспецифические), анамнестические и прививочные антитела, особенно к О-антигенам бактерий, принадлежат в основном к иммуноглобулину М (IgM) и могут содержаться в довольно высоком титре у многих здоровых людей.

Определение относительного содержания в сыворотках IgG - антител основано на том, что эти антитела устойчивы к обработке некоторыми редуцирующими веществами и, в частности, цистеином, тогда как IgM - антитела активируются этими реагентами.

РПГА в диагностике брюшного тифа, паратифов, других сальмонеллезов и дизентерии.

Кровь берут с соблюдением правил асептики из пальца с помощью оспопрививательных игл или шприцом из вены в стерильную пробирку. После образования сгустка его отделяют от стенок стеклянной палочкой или пастеровской пипеткой и ставят пробирку в холодильник. Не дозднее чем через 24 часа после взятия крови отсасывают сыворотку. Если сыворотка содержит примесь эритроцитов, ее центрифугируют.

Для постановки РПГА удобно использовать пластмассовые планшеты с лунками, в которых готовят последовательные двукратные разведения исследуемых сывороток. С этой целью вначале в лунки планшета наливают по 0,5 мл ИXH. Отдельно разводят в 50 раз исследуемую сыворотку (например, 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл ИХH), 0.5 мл сыворотки в этом разведении вносят в первую лунку. Содержимое лунки тщательно перемешивают градуированной пипеткой и 0,5 мл переносят во вторую лунку, а из второй после перемешивания - в третью и т.д. Обычно достаточно таким способом приготовить ряд из 5-6 разведений (до разведения 1:1600-1:3200). Из последней лунки 0,5 мл содержимого выливают и вносят во все лунки чистой пипеткой по 0,25 мл необходимого эритроцитарного диагностикума, ампулу с которым тщательно взбалтывают до полного исчезновения осадка эритроцитов. С целью экономии диагностикумов их можно вносить по 3 капли (не по 0,25 мл, а 0,15 мл). Пластины осторожно несколько раз встряхивают до получения гомогенной взвеси эритроцитов и ставят на 2-3 часа в термостат при 37⁰С или на ночь при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

Контролями диагностикумов служат: постановка реакции со стандартной иммунной сывороткой, вложенной в каждую упаковку диагностикума, - реакция должна быть положительной до разведения, указанного на ампуле с сывороткой; постановка реакции с 0,5 мл ИХН в 2-х лунках – реакция должна быть отрицательной.

Реакция гемагглютинации считается положительной в том случае, если эритроциты полностью агглютинировались и расположены равномерно по дну лунки, либо наряду с равномерно расположенными небольшая часть эритроцитов оседает в центре лунки в виде донного колечка или «пуговки». Иногда при положительной реакции края агглютината в лунках могут слегка сползать, и он принимает вид «зонтика». При отрицательном результате агглютината нет, а эритроциты оседают в центре лунки виде «пуговки» или ровного колечка.

При необходимости определения IgG -антител следует использовать L - или DL - цистеин как солянокислый, так и «свободный». Препарат должен быть чистым и содержать золу в виде сульфатов не более 0,2%, аммиак - не более 0,05%. Этим требованиям отвечает венгерский цистеин. Непосредственно перед обработкой сывороток готовят раствор цистеина (7 мг на 1 мл растворителя для L - цистеина и 20 мг для DL -цистеина). При этом солянокислый цистеин растворяют в 0,1 N растворе едкого натрия с таким расчетом, чтобы рН готового раствора был равен 7,0-7,2. «Свободный» цистеин сначала растворяют в половинном количестве ИХН, затем доводят рН до 7,0 - 7,2 0,1 N раствором едкого натрия и вновь доливают до нужного объема ИХН, т.к. «свободный» цистеин значительно слабее, чем солянокислый сдвигает рН раствора в кислую сторону. Допустимо использование отечественного цистеина который предварительно должен быть проверен, причем эталоном может служить венгерский или другой проверенный цистеин. С целью проверки рН применяют индикаторную бумагу. Раствор цистеина не может храниться длительное время, поэтому следует вначале приготовить необходимое разведение сыворотки.

Исследуемую сыворотку в разведении 1:5 смешивают с равным объемом цистеина, помещают в небольшие пробирки шли флаконы и плотно закрывают их резиновыми пробками (лейкопластырем). Объем пробирок (флаконов) должен быть таким, чтобы между содержимым и пробкой оставалось минимальное свободное пространство во избежание инактивации цистеина кислородом воздуха. Пробирки с сыворотками, обработанными цистеином, выдерживают в течение 18-20 часов в термостате при 37 С. В таких же условиях выдерживают вторую часть исследуемой сыворотки (без цистеина), разведенную 1:10 с применением ИХН. На следующий день обе части сыворотки титруют, начиная с разведения 1:20. В качестве основы для титрования сывороток, обработанных цистеином, необходимо использовать забуференный ИХН (фосфатный буфер рН 7,0-7,2), однако предпочтительней готовить ИХН на нормальной, прогретой при 56⁰С в течение 30 минут сыворотке (кроличьей, лошадиной, крупного рогатого скота). Нормальную сыворотку добавляют из расчета 1 мл на 100-200 мл ИХН (рН 7,0-7,2) при условии, что в принятом разведении нормальной сыворотки отсутствуют антитела к применяемым диагностикумам. Это про­веряют предварительно для каждой новой серии нормальной сыворотки.

С целью диагностики брюшного тифа и паратифов сыворотки следует титровать с помощью О-диагностикумов серогрупп А, В и D, а также Н-диагностикумов 1 фазы а, b, d и vi - диагностикума. Четкое нарастание в динамике болезни титра суммарных антител к определенным антигенам и особенно увеличение уровня IgG - антител, устойчивых к цистеину, дает веские основания для подтверждения клинического диагноза. Необходимо учитывать, что при паратифе А титры 0 - антител на протяжении заболевания могут быть ниже чем при брюшном тифе и паратифе В.

В случае позднего поступления больного в стационар (в разгар болезни) условно диагностическим титром суммарных О - и Н - антител следует считать дополнительный результат в разведении не ниже 1:640, а для vi - антител 1:80-1:100. Минимальным условно диагностическим титром IgG О- и Н-антител считают разведение 1:80, а для IgG vi-антител 1:40 (при паратифе А «диагностические титры могут быть в 2 раза ниже).

При позднем серологическом обследовании больного и отсутствии бактериологического подтверждения диагноза целесообразно исследовать сыворотку в периоде реконвалесценции, чтобы выявить снижение общего титра антител и уменьшение удельного содержания цистеинустойчивых IgG –антител, что также может помочь поставить правильный диагноз.

С целью диагностики сальмонеллезов сыворотки вначале титруют с комплексным диагностикумом (серогрупп А, В, C₁, C₂, D и Е). При нарастании уровня антител или достаточно высоком титре (для взрослых не ниже 1:400, для детей до полугода - 1;100, для детей от 6 месяцев до 1 года - 1:200), следует повторить исследование сыворотки со всеми групповыми 0-диагностикумами и повторить РПГА с цистеиновой пробой. Это необходимо для уточнения этиологии заболевания и потому, что комплексный диагностикум недостаточно специфичен. Условно диагностическим титром суммарных антител считают положительный результат реакции в разведении 1:400, а цистеинустойчивых IgG -антител 1:80 (для детей до 1 года 1:20).

С целью диагностики дизентерии сыворотки титруют с эритро-цитарными диагностикумами Флекснера (из S.flexneri 1-5) Зонне (из S.sonnei), Ньюкастл (из S.flexneri 6) Григорьева-Шига (из S.dysenteriae 1) и Штуцера-Шмитца (из S.dysenteriae 2). Минимальным условно-диагностическим титром к диагностикуму Флекснера для взрослых считают положительный результат реакции в разведении 1:400, для детей до 3 лет - 1:100, старше 3 лет - 1:200; для остальных диагностикумов - 1:200. В связи с большим числом неспецифических положительных результатов этой реакции, в особенности в отношении диагностикумов Флекснера и Зонне, достоверным положительным результатом следует считать не менее чем четырехкратное нарастание титра в динамике заболевания, а также наличие титра цистеинустойчивых антител 1:80 и выше.

РПГА с цистеином может оказаться полезной для постановки правильного диагноза в случаях смешанной инфекции и при выделении двух или нескольких представителей энтеробактерий, этиологическая роль каждого из которых не ясна. При истинной микст-инфекции антитела и особенно цистеинустойчивые будут нарастать к каждому из предполагаемых возбудителей. Если же к какому-то из предполагаемых возбудителей, нарастание антител, и в том числе IgG, не будет выявлено, и при этом отсутствуют клинические симптомы заболевания, то можно считать, что выделение возбудителя носит случайный, транзиторный характер.

В случае формирования острого и особенно затяжного бактерионосительства (при брюшном тифе, паратифах, реже при сальмонеллезах и других инфекциях) характерно выраженное нарастание IgG -антител, при этом основное значение имеет не абсолютный титр антител, а относительное содержание в сыворотке цистеиноустойчивых антител. Если обработка цистеином не снижает титр, либо снижает его только на одно, максимум на два разведения, это свидетельствует о значительном содержании в сыворотке IgG-антител, у такого обследованного следует заподозрить острое или хроническое бактерионосительство (при отсутствия клинических проявлений).

При длительном бактерионосительстве титр О-антител может быть и низким (иногда 1:20 - 1:40), но эти антитела практически целиком определяются IgG - антителами. Для хронических носителей тифозных бактерий характерны довольно высокие титры vi - антител (в большинстве случаев выше 1:80) и Н - антител (1:320 и выше), которые почти не снижаются при обработке цистеином.

Отмеченная закономерность может нарушаться у хронических носителей тифозных бактерий, инвазированных описторхами. Это необходимо принимать во внимание при обследования населения территорий, на которых распространен описторхоз.

РПГА с цистеином может быть применена с целью контроля прекращения бактерионосительства. Если на фоне прекратившегося бактериовыделения значительно снизится титр антител и особенно цистеинустойчивых IgG, то можно предположить, что произошло освобождение организма от возбудятеля. Прекращение бактерионосительства чаще наблюдается при дизентерии, сальмонеллезах, значительно реже - при брюшном тифе.

Для транзиторных бактерионосителей характерен невысокий титр антител, обусловленный IgM. Если после обработки цистеином в сыворотке остаются IgG - антитела в титре 1:40 и выше, то у такого лица можно предполагать наличие либо субклинической формы инфекции, либо продолжающееся бактерионосительство.

Некоторое повышение титра IgG - антител может происходить в результате многократной специфической вакцинации, поэтому при анализе результатов реакции следует учитывать прививочный анамнез.

Реакция агглютинации с бактериальными диагностикумами при диагностике брюшного тифа, паратифов, других сальмонеллезов и дизентерии.

Исследуемые сыворотки разводят тем же способом, что и для РПГА только в пробирках. В каждый ряд агглютинационных пробирок с разведениями сыворотки и в контрольную (с 0,5 мл ИХН) добавляют по 2 капле соответствующего диагностикума, штатив с пробирками несколько раз встряхивают и помещают в термостат при 37⁰С на ночь. Учет результатов реакции рекомендуется проводить с помощью агглютиноскопа, осторожно встряхивая осадок или медленно наклоняя пробирку. При положительной реакции осадок равномерным слоем покрывает дно пробирки. Края его часто бывают неровные (форма «зонтика»). Надосадочная жидкость прозрачна. После легкого встряхивания пробирки в прозрачной надосадошюй жидкости всплывают хлопья или зерна агглютината. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдают хорошо выраженную агглютинацию, считают ее титром. При отрицательной реакции взвесь сохраняет исходную мутность так же, как в контроле диагностикума.

Условно диагностическим титром считают положительный результат реакции агглютинации с брюшнотифозными и другими сальмонеллезными диагностикумами в разведении 1:200, с диагностакумами Флекснара - 1:400, Зонне, Ньюкастл, Григорьева-Шига, Штуцера-Шмитц - 1:100.

Необходимо помнить, что эти титры не могут служить достоверным доказательством заболевания. Значительно более надежными следует считать увеличение титров в динамике болезни.

Реакция агглютинации с аутоштамами в диагностике заболеваний, вызываемых условно патогенными энтеробактериями.

Диагностическая ценность этой реакции в значительной мере связана с выявлением характера антителообразованяя в динамике заболевания. Оптимальные сроки взятия сыворотки 1-2, 7-10, 14-15-й дни заболевания. Полученные от больного сыворотки следует сохранять в холодильнике и исследовать одномоментно («парные сыворотки»). При специфическом иммунном ответе в конце первой - начале второй недели болезни титр антител нарастает не менее чем в 4 раза, а затем постепенно снижается.

При выделении подвижных культур, представители родов Escherichia, Edwardsiella, Citrobater, Enterobacter, Proteus и др., сыворотку больных исследуют на Н- и О-антитела.

Для Н-агглютинации культуры выращивают на свежескошенном слабо-щелочном питательном агаре в течение 18 часов, затем смывают ИХН и доводят взвесь бактерии до густоты 1 млрд/мл. В ряду из 5 обычных агглютинационных пробирок с 0,25 мл ИХН титруют исследуемую сыворотку, начиная с разведения 1:50, после чего вносят в каждую пробирку, включая одну контрольную с 0,25 мл ИХН по 0,25 мл приготовленной бактериальной взвеси. Штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат пря 37⁰С на 12 ч. Учитывают реакцию, осторожно покачивая пробирку. Агглютинат имеет вид хлопьев. При невозможности взятия сывороток в динамике болезни ориентировочным титром считают положительный результат реакции Н-агглютинации в разведении 1:100-1:200.

Для 0-агглютинации используют взвесь убитой кипячением суточной агаровой культуры бактерий густотой в 3 млрд/мл ИХН.

Перед постановкой реакции бактериальную взвесь необходимо 2-3 раза отмыть путем центрифугирования. Исследуемую сыворотку титруют в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:10 на ИХН в серологических пробирках. В каждую пробирку, включая контрольную, вносят по 1 капле приготовленной бактериальной взвеси, штатив встряхивают и помещают в термостат при 37⁰С на 12 ч. В случае положительной реакции О -агглютинат при осторожном встряхиваний имеет мелкозернистый характер. При невозможности обследования больного в динамике и получении лишь одной сыворотки позже 5 дня болезни условно-диагностическим титром считают положительную реакцию в разведения 1:20 и выше.

ГЛАВА 15

(ВОДА, СМЫВЫ)

При исследовании следует обращать внимание на разделочные доски, мясорубки, производственные столы для готовой пищи, особенно в цехе приготовления холодных закусок. Смывы с крупного оборудования берут с поверхности 100см², с использованием трафарета, площадью 25см³. При взятии смывов с мелких инструментов обтирается вся поверхность предмета, при заборе смывов с тарелок протирают всю внутреннюю поверхность. При взятии смывов с мелких предметов одним тампоном протирают три одноименных предмета. У столовых предметов протирают их рабочую часть, при исследовании стаканов протирают внутреннюю поверхность и верхний наружный край стакана на 2 см вниз. При взятии смывов с рук протирают тампоном ладонные поверхности обеих рук, проводя не менее пяти раз по каждой ладони и пальцам, затем протирают межпальцевое пространство, ногти и подногтевые пространства. При взятии смывов с санитарной одежды протирают четыре площадки по 25 см², с различных мест полотенца берут четыре площадки по 25 см². При взятии смывов с яичной скорлупы один тампон используют для исследования 10 яиц.

Взятие смывов проводят с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов на стеклянной или деревянной палочке, или небольшими марлевыми салфетками (5х5 см), простерилизованными в бумажных пакетах или в чашках Петри. Для увлажнения тампонов в пробирки с тампонами наливают по 5,0 мл стерильного раствора нейтрализатора. При применении дезинфектантов, содержащих хлор или перекись водорода, в качестве увлажняющей жидкости следует использовать раствор нейтрализатора (1% пептонная вода + 3% ТВИН-80 + 0,5% тиосульфата натрия), при применении других - 1% пептонная вода + 3% ТВИН-80 + 0,3% лецитина. При использовании салфеток стерильный раствор нейтрализатора разливают в стерильные флаконы по 5,0 мл. Салфетку захватывают стерильным пинцетом, увлажняют нейтрализатором и, после протирания исследуемого объекта, помещают во флакон. В исключительных случаях для увлажнения тампонов используют стерильный ИХН, или 0,1% пептонную воду, разлитые во флаконы по 5 мл, тампоны увлажняют непосредственно перед взятием смывов. При обработке жирной поверхности следует пользоваться сухими тампонами.

Для выделения стафилококков производят посев смывной жидкости непосредственно на чашку Петри с желточно-солевым агаром, тампон помещают в среду накопления (бульон с 6,5% хлористого натрия, бульон с 1% глюкозы), разлитые в пробирки по 5 мл. Засеянные пробирки инкубируют при 37⁰С в течение 20-24 часов, после чего делают высев на ЖСА. Идентификацию выделенной культуры проводят как описано в главе настоящей Инструкции.

Определение БГКП с идентификацией до E.coli. К БГКП относятся факультативно-анаэробные, грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу (глюкозу) с образованием кислоты и газа при (37 + 1)⁰С в течение 24-48 часов, в основном, являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т.е. учитываются цитратположительные и цитратотрицательные варианты БГКП).

Для выявления БГКП производят посев на среду обогащения, для чего тампон (марлевую салфетку) погружают в 10-20% желчный бульон или среду Кесслера. Через сутки инкубирования при 37⁰С делают пересев на среду Эндо.

При отсутствии на среде Эндо колоний, типичных для БГКП (красных и темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых или бледно-розовых), выдают заключение об отсутствии БГКП. При наличии на среде Эндо характерных колоний из них готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют; выполняют пробу на оксидазу. Наличие в мазках грамотрицательных, оксидазоотрицательных палочек предполагает присутствие БГКП. Исследуемые колонии засевают на среду Гисса с лактозой или глюкозой. Инкубируют 37⁰С 24 часа. Первичный учет проводят через 4-6 ч. Производят пересев на среду Эндо. Все типичные колонии подвергают идентификации по ИМАЦ-тестам (реакция на индол, реакция с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра, утилизация цитрата). Дальнейшее исследование с идентификацией до E.coli проводят как описано в главе 5 настоящей Инструкции.

При выявлении на среде Эндо мелких бесцветных колоний, подозрительных на наличие возбудителей кишечных инфекций, колонии снимают и изучают на принадлежность к патогенным микроорганизмам семейства Enterobacteriaceae.

При целенаправленном исследовании на выявление бактерий рода Salmonella в пробирку наливают 2 мл предварительной среды обогащения - забуференной пептонной воды рН7,0 (готовят как фосфатно-буферную смесь, но вместо дистиллированной воды используют пептонную воду). Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют, забирают смыв, тампон погружают в предварительную среду обогащения, инкубируют при 37⁰С в течение 24 ч. После инкубирования пересевают в среду обогащения (селенитовую, магниевую), в пробирку с посевом смыва добавляют 10 мл среды. Инкубируют при 37⁰С в течение 24 ч, производят пересев на чашки Петри с плотными питательными средами (висмут-сульфит агар, среда Плоскирева, Эндо, ЭМС и др.), посевы инкубируют при 37⁰С в течение 24 ч. Идентификацию выделенных культур проводят как описано в главе 3 настоящей Инструкции.

При санитарно-бактериологическом контроле на предприятиях пищевой промышленности, общественного питания, торговли пищевыми продуктами, в учреждениях для детей, в организациях здравоохранения возможно применение метода отпечатков на «Бактотесты» (метод обнаружения БГКП), исследования проводятся по МУК РБ 11-15-3-2002.

Исследование проб воды для определения патогенных бактерий кишечной группы проводят по МУК РБ № 11-10-1-2002 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».
ГЛАВА 16

УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

Препараты для исследования готовят путем непосредственного нанесения материала на предметное стекло, или с предварительным подращиванием на питательных средах. В первом случае при исследовании жидкого материала делают тонкий мазок, при оформленном стуле, или исследовании пищевых продуктов, готовят 20 % суспензию в ИХН. Для мазка используют верхнюю часть суспензии после ее отстаивания в течение 20 мин. или центрифугировании при 1000 оборотов в мин. в течение 5-10 мин. При подращивании в средах обогащения их выдерживают при 37⁰С в течение 18-24 ч, на плотных средах 24 ч – после чего готовят мазки. Для выявления энтеробактерий используют прямой и непрямой метод.

Прямой метод – мазки исследуемого материала подсушивают на воздухе и фиксируют 96⁰С этиловым спиртом в течение 15 мин или путем трехкратного проведения через пламя горелки. Препараты помещают во влажную камеру, наносят на них каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении на срок, указанный в наставлении по применению люминесцирующей сыворотки. После экспозиции мазки промывают ИХН в течение 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. Фиксированные мазки можно хранить несколько дней в холодильнике. Микроскопируют в люминесцентном микроскопе, необходимо просматривать не менее 20-25 полей зрения. Бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, имеют яркое зеленоватое свечение периферии клетки, по морфологии соответствующей энтеробактериям. Такое свечение называют специфическим, в отличии от неспецифического, характеризующегося равномерным свечением всего тела клетки. Для оценки интенсивности свечения используют систему четырех плюсов: + + + + очень яркая флюоресценция на перифирии клеток, четко контрастирующая с темным телом бактерий; + + + яркая флюоресценция перифирии клетки; + + или + слабое свечение перифирии клетки не контрастирующая с телом клетки. Положительным результатом считают реакции на + + + + или + + + при наличии 2-5 и более специфически светящихся клеток в каждом поле зрения. В отношении антигенно обособленных энтеробактерий например S.sonnei, для положительного ответа достаточно обнаружить в препарате единичные ярко светящиеся палочковидные микробы. Прямая микроскопия мазка из нативного материала от больных при высокой концентрации возбудителя (500 тысяч -1млн клеток в 1 г, позволяет дать положительный ответ через 45-60 мин.

Непрямой метод на препарат, содержащий антиген, наносят капли диагностической немеченой сыворотки и оставляют при комнатной температуре на 10-20 мин (во влажной камере), промывают ИХН дважды по 10 мин. Мазки подсушивают на воздухеи на 10-20 мин наносят капли люминесцирующей антивидовой сыворотки против глобулинов того вида животного, от которого получена примененная иммунная сыворотка. Мазки промывают и просматривают как при прямом методе. Для непрямого метода обязателен контроль: изучаемый антиген обработанный люминесцирующей сывороткой.

Метод применяют в качестве экспресс-метода индикации. Окончательное заключение может быть выдано только на основании выделения из исследуемого материала возбудителя и полной его дальнейшей идентификации.

Для ускоренного микробиологического исследования пищевых продуктов возможно использование автоматизированных экспресс-методов с использованием микробиологических экспресс-анализаторов,представляющих собой измерительные системы для определения микробной обсемененности и выявления различных микробов, принцип действия которых основан на регистрации изменения электрического сопротивления (импеданса) питательной среды, оптической плотности, турбидиметрического или колоримитрическогоэффекта питательных сред, происходящего под влиянием процессов роста и жизнедеятельности микроорганизмом в исследуемой пробе. Среди разработанных и применяющихся в настоящее время микробиологических экспресс-анализаторов, предназначенных для обнаружения микроорганизмив на основе импедансных технологий наибольшее распространение получили приборы серии «Вак Трак 4000». Прибор автоматически определяет сальмонеллы, энтерококки, S.аureus, B.сereus и др. микроорганизмы, через 6-8 ч можно получить сигнал о возможной обсемененности продукта этими микроорганизмами.

ГЛАВА 17

Состав:

Глицерин нейтральный 500 мл

Натрий гидрофосфат безводный

(Na₂HPO₄) 20 % раствор 150 мл

Приготовление: смешивают первые два ингредиента и добавляют раствор натрия гидрофосата в таком количестве, чтобы довести рН до 7,8-8,0, а затем разливают в пробирки или флаконы по 10 мл, стерилизуют в автоклаве при 112⁰ С в течение 15 мин или текучим паром 3 дня подряд. После стерилизации рН 7,6-7,8.
Фосфатно-буферная смесь.

Состав:

Натрий гидрофосфат безводный

(Na₂HPO₄) 5,34 г

Вода дистиллированная 1000 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, разливают по 10 мл в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве при 120⁰С 30 мин.
Изотонический раствор натрия хлорида.

Состав:

Вода дистиллированная 1000 мл

Приготовление: соль растворяют при подогревании, фильтруют, устанавливают рН 7,0-7,2, разливают в пробирки по 5-7 мл, стерилизуюь при 121⁰С 30 мин.

Селенитовая среда.

Состав:

Дистиллированная вода 1000 мл

Пептон 5 г

Натрий фосфорнокислый

двузамещенный, безводный (Na₂HPO₄) 7г

Натрий фосфорнокислый однозамещенный (NaH₂PO₄) 3 г

Лактоза (химически чистая) 4 г

Приготовление:

Раствор № 1. Для приготовления селенитовой среды необходима предварительная подтитровка ее составных частей так, чтобы рН >не был выше 7,0(6,9-7,1), что достигается путем изменения соотношения фосфатных солей. Причем подтитровка проводится всякий раз, когда меняется серия любого из вхо­дящих в среду основных ингредиентов (пептон, кислый селенистокислый натрий, фосфаты).

К приготовленному раствору фосфатных солей в воде (1000 мл) до­бавляют пептон и лактозу.

Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром в те­чение 2-х дней по 30 минут или при температуре 112⁰С в течение 30 минут.

Раствор № 2. Отдельно на стерильной дистиллированной воде готовят 10% раствор кислого селенистокислого натрия. Перед началом работы в каждый фла­кон с 50 мл раствора № 1 добавляют 2 мл 10% раствора кислого селени­стокислого натрия.

Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл и закрывают плотно пробками. Стерилизация готовой среды не допускается, так как при этом проис-дит редукция селенита натрия, выпадает красный осадок и среда становится непригодной. Раствор № 1 может храниться, в холодильнике в течение 1-2 месяцев.

Раствор № 1:

Пептон 8,4 г

Хлористый натрий (NaCl) 14,3 г

Дрожжевой диализат 40,0 мл

Калий фосфорнокиелый (КН₂РО₄). 2,85 г

Вода дистиллированная 890,0 мл

Раствор № 2:

Хлористый магний кристаллический (MgCl₂ .6H₂O) 71,4 г

Вода дистиллированная 90,0 мл

Раствор № 3:

0,5% водный раствор бриллиантового зеленого 1,8 мл

После растворения всех ингредиентов растворы соединяют, разливают определенные объемы в колбы, флаконы или пробирки и стерилизуют при 112⁰С 30 минут.

Пропись предусматривает посевы равных объемов исследуемой жидкости и среды обогащения. При исследовании плотного материала в состав среды вводится двойное количество дистиллированной воды.

К 90 мл стерильного бульона Хоттингера добавляют: 4,5г мела, предварительно простерилизованного сухим жаром; 10 мл раствора натрия тиосульфата (50 г чистого кристаллического натрия тиосульфата в 100 мл дистиллированной воды стерилизуют текучим паром); 2 мл раствора Люголя (металлического йода 25 г, йодистого калия 20 г, дистиллированной воды 100 мл). Указанные ингредиенты смешивают, взбалтывают, разливают по пробиркам. Готовая среда стерилизации не подлежит.

Состав:

Среда Мюллера (стерильная) Стерильная бычья желчь 0,1% водный раствор бриллиантового зеленого

1000 мл 50 мл 10 мл

Перемешать, разлить в стерильные пробирки, не стерилизовать.
Тетратионатная среда (Мюллер-Кауфман)

Основа среды: в 100см³ мясо-пептонного бульона добавляют 4,5 г стерильного углекислого кальция. Стерилизуют при 121⁰С 20 минут. К 100см³ основы среды асептически прибавляют: 10см³ раствора гипосульфита натрия Na₂ S ₂O₃. 5Н₂О, 2см³ йодного раствора, 0,2 см³ раствора бриллиантового зеленого, 5см³ раствора желчи. Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления. Среду допускается использовать в течение одной недели после приготовления.

Раствор гипосульфита натрия: 50,0г гипосульфита натрия помещают в колбу вместимостью 100см³, растворяют в дистиллированной воде и доводят до метки. Раствор переливают в колобу или флакон и стерилизуют текучим паром 30мин или при 121⁰С 20 минут.

Йодный раствор: 25,0г йодистого калия помещают в колбу вместимостью 100см³ растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, прибавляют 20г кристаллического йода, растворяют, объем растворв доводят дистиллированной водой до метки, хранят в плотно закрытом темном сосуде.

Раствор бриллиантового зеленого: 0,5г бриллиантового зеленого переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде, раствор переливают в колбу вместимостью 100см³ и доводят дистиллированной водой до метки, хранят в плотно закрытом темном сосуде при комнатной температуре не более 3 месяцев.

Раствор желчи: 10,0г сухой желчи растворяют в 100см³ количестве дистиллированной воды, или используют натуральную желчь, стерилизуют при 121⁰С 20 минут.

10,0г пептона, 5,0г хлористого натрия, 9,0г двузамещенного фосфарнокислого натрия (Na₂HPO₄ . 12 H₂O) 1,5г однозамещенного фосфарнокислого калия растворяют при нагревании в 1000см³ дистиллированной воды, устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при 25⁰С 7,0+0,1, стерилизуют при 121⁰С 20 мин.

Состав:

Мясо-пептонный бульон Стерильная бычья желчь Глюкоза Раствор индикатораАндредэ

1000 мл 100мл 20г 10мл

Состав:

Мясная вода	1000 мл
Дрожжевой экстракт жидкий	100 мл
или
Дрожжевой экстракт по сухой массе Пептон Натрий хлорид (NaCl) Агар Железо (II) сульфат (FeSO4-7H2O), перекристаллизованное Натрий тиосульфат (Na2S2O3-5H2O) Глюкоза Лактоза Сахароза Феноловый красный (0,2 % водный раствор)	3 г 20 г 3,5 г 15 г 0,2 г 0,3 г 1,0 г 10 г 10 г 12 мл

Приготовление: готовят основу, к мясной воде добавляют дрожжевой экстракт, пептон, натрия хлорит и агар. Смесь подогревают до расплавления агара, устанавливают рН 7,0-7,1. Фильтруют, разливают во флаконы по 0,5 л, стерилизуют при 121⁰С 30 мин. К стерильной основе добавляют остальные ингридиенты, разливают асептично в пробирки по 6-7 мл, стерилизуют при 112⁰С 30 мин. Скашивают в горячем виде, так, чтобы оставить столбик высотой 2,5-3,0 см.
Трехсахарный агар с мочевиной (среда Олькеницкого)

Состав:

Агар питательный сухой Лактоза Сахароза Глюкоза Аммоний-железо (II) сульфат (FeZO4.(NH4)2SO4.6Н2О) Натрий тиосульфат (Na2S2O3.5H2O) Мочевина Феноловый красный (0,4 % водный раствор) Вода дистиллированная

25 г 10 г 10 г 1 г 0,2 г 0,3 г 10 г 4 мл 1000 мл

Соли предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Углеводы и мочевину растворяют таким же образом, но при подогревании в водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в остальной воде при нагревании на огне и помешивании. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2-7,4. Добавляют индикатор, хорошо перемешивают, разливают в пробирки по 6-7 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Скашивают, оставляя столбик 2-2¹/₂ см.

Готовая среда бледно-розового цвета.

Готовится из диетических яиц. Скорлупу яиц тщательно обрабатывают спиртом. Содержимое яиц сливают в стерильную колбу с бусами, встряхивают до образования гомогенной массы, добавляют стерильный фи­зиологический раствор из расчета 25 мл на 1 яйцо.

Смесь разливают в стерильные пробирки по 4-5 мл и скашивая продевают в аппарате Коха при 80⁰С в течение 1 часа 2 дня подряд. Среда не подлежит стерилизации.
Раппапорт-Вассилиадис соево-пептонный бульон (RVS).

Основа:

Хлорид натрия 8г.

KH₂PO₄ 1,4г.

K₂HPO₄ 0,2г.

Дистиллированная вода 1000мл.

Нагреть содержимое до 80⁰С, до полного растворения ингридиентов. Раствор хранится один день.

Раствор хлорида магния:

Хлорид магния 400г.

Дистиллированная вода 1000мл.

Растворить хлорид магния в воде. Хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 2 часов.

Раствор малахитового зеленого:

Оксалат малахитового зеленого 0,4г.

Дистиллированная вода 100мл.

Растворить соль в воде. хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 8 месяцев.

Состав среды:

Основа 1000мл.

Раствор хлорида магния 100мл.

Раствор малахитового зеленого 10мл.

Смешать компоненты среды и разлить содержимое по 10мл в пробирки. Автоклавировать при 115⁰С в течение 15мин. Проверить рН, которое после стерилизации должна быть 5,2+0,2 при 25⁰С. Хранить при 4⁰С максимум 4 месяца.
Бриллиантовый-зеленый агар (BGA).

Состав:

Дрожжевой экстракт 3г.

Хлорид натрия 5г.

Лактоза 10г.

Сахароза 10г.

Феноловый красный 0,09г.

Бриллиантовый зеленый 0,0047г.

Агар 12г.

Дистиллированная вода 1000мл.

Все ингридиенты растворить в воде и нагреть содержимое в течение 1мин. Проверить рН среды (6,7-7,1) и разлить в бутылки по 1000мл. Не автоклавировать.

Состав:

Мясопептонный бульон	1000 мл
Натрий хлористый (NaCl)	20 гр
Феноловый красный	0,02 гр
Агар	15 гр

Смешивают все ингредиенты и нагревают до кипения и полного растворения всех ингредиентов. Затем охлаждают до 50⁰С, устанавливают рН 8,6 и стерилизуют при 121⁰С - 15 минут. Охлаждают до 50⁰С и добавляют 100 мл раствора висмут-сульфита и 1 мл 95 % этилового спирта.
Раствор висмут-сульфита.

Растворяют 100 г сернисто-кислого натрия (Na₂SO₃) в 500 мл кипящей воды (1); 30 г аммоний –висмут лимонно-кислого в 250 мл кипящей воды (2); 50 г сахарозы, 5 г маннита, 15 г бикарбоната натрия (NaНСO₃) в 300 мл кипящей воды (3). Растворы 1 и 2 смешивают и кипятят 1 минуту. Прибавляют раствор (3) и смешивают. Раствор хранят в холодильнике в течение 1 месяца.

Состав:

Дистиллированная вода Пептон Хлористый натрий (NaCl) Хлористый калий (КС1) Хлористый магний (MgСl2-6H2O)

950 мл 10 г 25 г 0,7 г 5 г

Устанавливают рН 9,1 добавлением 10% водного раствора углекислой соды. Стерилизуют при 121⁰С 15 минут, охлаждают до комнатной температуры и добавляют асептично 100 мл раствора Сернистокислого висмута и 1 мл этилового спирта 96°.

Хорошо смешивают и разливают асептично в (стерильные пробирки по 10 мл.

Приготовление раствора сернистокислого висмута.

Растворяют 1-20 г сернистокислого натрия (Nа₂SO₃) в 100 мл кипящей воды, 2-0,1 г аммоний-висмут лимоннокислого в 100 мл ки­пящей воды и 3-20 г маннита в 100 мя (кипящей воды. Смешивают растворы 1 и 2, кипятят, смесь в течение 1 минуты и добавляют раст­вор 3. Готовая смесь имеет белый цвет, мутная; перед использованием перемешать. Раствор можно хранить месяц в холодильнике.

Состав:

Дрожжевой экстракт Пептон Натрий хлористый (Nad) Манвит Агар 0,1% кристалл-виолет

5 г 10 г 70 г 5 г 15 г 0,01 мл

Состав:

Этиловый спирт 80 мл

К расплавленному и охлажденному до 45-60⁰С агару добавляют этиловый спирт и после перемешивания эмульсию яичных желтков. Тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 3 суток. Эмульсию яичных желтков готовят путем эмульгирования отделенных от белка 2 желтков в 10 мл стерильного физиологического раствора.

Состав:

Трехзамещенный цитрат натрия 2,5 г

Хлористый литий (LiCe.H₂O) 2,5 г

Стерилизуют при 110⁰С 30 минут, охлаждают до 45-50⁰С и добавляют полимиксин «М» 200 000 ед. и эмульсию двух желтков.

Тщательно (перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 7-10 дней.
Солевой-полимиксиновый агар с 2, 3, 5-трифенил-тетразолий хлоридом (ТТХ)

Состав:

Хлористый натрий (NaCl) 60 г

Полимиксин «М» 200 000-400 000 ед.

2, 3, 5 - трифенилтетразолий хлорид 0,1—0,2 г

В агар после расплавления и охлаждения до 46-50⁰С добавляют полимиксин, 2, 3, 5-ТТХ и эмульсию желтков, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 7-10 дней.

В качестве основы используют селективный солевой агар для стафилококков. По прописи, указанной на этикетке, готовят агар. К расплавленному и охлажденному до 45-50⁰С агару добавляют 20 % желточной взвеси (асептически извлеченный из яйца желток взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Смешивают агар с желточной взвесью, разливают по 20 мл в чашки Петри. Хранят в холодильнике в течение 2-х недель.

К расплавленному и охлажденному до 45-50⁰С солевому агару добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока, смешивают и разливают среду в чашки Петри. Хранят в холодильнике не более 2-3-х дней.

6,0 г хлористого натрия растворяют в 100 см³ мясо-пептонного бульона, устанавливают р Н так, чтобы после стерилизации он составлял при 25⁰С 6,9+1. Бульон разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при (121+1) ⁰С в течение 15 мин.

1,0 г глюкозы растворяют в 100 см³ мясо-пептонного бульона, устанавливают р Н так, чтобы после стерилизации он составлял при 25⁰С 6,9+1. Бульон разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при (121+1) ⁰С в течение 15 мин.

6,1 г трисаминометана растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, доводят рН раствора до (9,0+0,1). К раствору добавляют 0,3 г ДНК, 10 г хлористого натрия, 1,1 см³ раствора хлористого кальция концентрации 1 г/дм³, 15 г агара, нагревают до полного расплавления агара. К охлажденной до 55-65⁰С среде добавляют 9,2 см³ раствора толуидина синего (1,0 г толуидина синего «С» растворяют в 100 см³ дистиллированной воды) перемешивают и разливают по чашкам Петри. Хранить среду при температуре (6,0+2,0) ⁰С не более 7 суток

Состав:

мясо-пептонный бульон 1000 мл.

хлористый натрий (NaCl) 5 г.

агар-агар 15 г

б) 0,05% водный раствор кристалл-виолета

в) 5,0% водный раствор азида натрия (NaN₃)

г) цитратная или дефибрвнврованная кровь кролика или человека.

Части «а» и «б» стерилизуют при 12⁰С в течение 20 минут, часть «в» стерилизуют текучим паром 30 минут.

Для приготовления среды берут стерильно:

основного агара расплавленного и охлажденного до 45⁰С 100 мл.

0,05% водного раствора кристал-виолета 0,4 мл.

5,0% водного раствора азида натрия 1 мл.

цитратиой или дефибрннироваиной крови 5 мл.

Все тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки со средой можно хранить в холодильнике не более 7 дней.
Молочная среда с полимиксином (среда Калины)

Состав:

01% водный раствор кристаллвиолета 125мл

10% водный раствор 2, 3, 5-ТТХ 0,5 мл

Стерильное обезжиренное молоко 15 мл

Полимиксин «М» 20000-40000

Все ингредиенты смешивают асептично и среду тонким слоем разливают в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить в холодильнике 7-10 дней.

Состав:

Автолизат дрожжевой 20 мл

Глюкоза 10 г

Дистиллированная вода 800 мл

Расплавляют при нагревании, профильтровывают, стерилизуют при 112⁰С 15 мин, рН 7,2-7,4. Перед разливкой в чашки, в питательную среду добавляют ТТХ 0,1 г водного раствора кристаллического фиолетового 0,01 % 12,5 мл, налидиксовой кислоты 0,1 г, стерильного обезжиренного молока подогретого до 45⁰С 200 мл, свежей дефибринированной крови (животного или человека) 50 мл. Содержимое размешивают и разливают по чашкам по 7 мл.
Сахарно-дрожжевой питательный агар

Состав:

Дрожжевой автолизат 20 мл

Глюкоза 10 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Расплавляют при нагревании, стерилизуют среду при 112⁰С 15 мин, рН 7,2-7,4.
Сахарно-дрожжевой питательный агар с теллуритом калия.

Состав:

Дрожжевой автолизат 20 мл

Глюкоза 10 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Приготовленную смесь расплавляют при нагревании, добавляют лимоннокислого натрия 5,0 г.

Стерилизуют среду при 112⁰С 15 мин, рН 7,2-7,4. Перед разливкой среды в стерильные чашки добавляют 50 мл лошадиной сыворотки, 0,1 г налидиксовой кислоты и 0,7 г (35 мл 2 % водного раствора) теллурита калия, тщательно размешивают.

Компоненты, рассчитанные на 1000 мл сахарно-дрожжевого питательного агара, растворяют в 600 мл дистиллированной воды, вносят 400 мл медицинской желчи. Перед разливкой в чашки добавляют 50 мл крови человека, или животного, 12,5 мл 0,01 % раствора кристаллического фиолетового и 20 мл 10% раствора КОН.

К100 мл питательного бульона, рН 7,2-7,4 прибавляют 0,2 г глюкозы. Среду стерилизуют однократно 15 мин при 0,5 атм.

Состав:

дрожжевой экстракт 2 мл

хлористый натрий (NaCe) 0,5 г

агар-агар 1,5 г

глюкоза 1 г

2, 3, 5-ТТХ 0,01 г

Все ингредиенты, кроме ТТХ, автоклавируют при 121⁰С 10-12 мин. 2, 3, 5- ТТХ растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.
Среда с молоком

Состав:

молоко (стерильное) 20 мл

глюкоза 0,2 г

агар-агар 1,5 г

Стерилизуют при 121⁰С в течение 10-12 мин. Среда в чашках Петри нится в холодильнике не более 7-10 дни. Стерильное молоко добавляют в среду перед разливкой в чашки Петри.
Среда Китт-Тароцци.

Стерильные пробирки заполняют на 1-1,5 см кусочками печени, мяса или рыбы и заливают приготовленным мясо-пептонным бульоном с глюкозой и агаром. В 1 дм³ мясо-пептонного, рыбо-пептонного или печеночного бульона вносят 10 г глюкозы и 1,5 г агара, при нагревании постепенно расплавляют и стерилизуют при (121+1) ⁰С, рН проверяют до и после стерилизации (7,1+0,1). При приготовления среды впрок вместо добвления к ней агара на поверхность среды перед стерилизацией в пробирки наслаивают 0,5-1 см вазелинового масла. При применении среды Китт-Тароцци без добавления в нее агара или вазелинового масла на поверхность среды после посева наслаивают голодный агар или парафиновую смесь высотой 1-1,5 см. При посевах свежеприготовленную среду Китт-Тароцци (не более 3-х суток с момента приготовления) добавлять агар, вазелиновое масло или наслаивать на ее поверхность голодный агар не обязательно.

Печеночно-глицериновая среда.

К 1 дм³ печеночного бульона добавляют 5 г глицерина, 5 г глюкозы, разливают в пробирки или флаконы с кусочками печени (20-30 г печени на 100см³), устанавливают рН (7,0+0,1) и стерилизуют при (121+1)⁰С - 20 мин.

50 г триптического перевара казеина, 5,0 г пептона, 100 см³ дрожжевого экстракта, 4,0 г глюкозы, 1,0 г тиогликолята натрия добавляют к 900 см³ дистиллированной воды, устанавливают рН (7,0+0,1) и стерилизуют при (121+1)⁰С пробирки - 10 мин, флаконы – 15 мин. Хранят при комнатной температуре не более 7 суток. Применяют для культивирования C. Botulinum, образующих прототоксин, перед употреблением к 1000 см³ бульона добавляют 60 см³ 1,5 %-ного раствора трипсина в фосфатно-буферном растворе.

Раствор железоаммонийных квасцов концентрации 50 г /дм³ и раствор сернисто-кислого натрия с массовой концентрацией 200 г/дм³ готовя на стерильной дистиллированной воде, extempore. Раствор сернисто-кислого натрия стерилизуют текучим паром в течение 1 часа. К 100 см³ расплавленного и охлажденного до 80⁰С мясо-пептонного агара концентрации глюкозы 10 г/дм³ добавляют 10 см³ раствора сернисто-кислого натрия и 1 см³ раствора железоаммонийных квасцов. Устанавливают рН 7,5-7,8.

К стерильному молоку добавляют лакмусовую настойку до получения сиреневого окрашивания (на 100 см³ молока – 1 см³ лакмусовой настойки). Лакмусовое молоко разливают по стерильным пробиркам высоким столбиком, кипятят на водяной бане 15-20 мин и охлаждают для посева до 45⁰С.

Питательные среды для выделения и идентификации кампилобактерий.
Транспортная среда Кери-Блэр.

Растворить в 991мл дистиллированной воды при нагревании на водяной бане следующие ингридиенты: натрия тиогликолят – 1,5г, натрия фосфат двузамещенный – 1,1г, натрия хлорид -5г, агар-агар – 1,6г. При исследовании материала методом мембранных или ядерных фильтров количество агар-агара необходимо уменьшить до 0,4-0,5г. В охлажденную до 40-45⁰С основу добавить 9мл свежеприготовленного 1% раствора кальция хлорида. Установить рН 8,4. Разлить по 10-12 мл в стерильные центрифужные пробирки, стерилизовать 120⁰С 30мин.

Транспортная среда Амиеса.

Состав:

Уголь активированный	10г
натрия хлорид	3г
Na2HPO4	1,15г
KH2PO4	0,2г
KCl	0,2г
CaCl2	0,1г
MgCl2	0,1г
натрия тиогликолят	1г
агар-агар	4г
вода дистиллированная	1л

Разлить по пробиркам и стерилизовать 121⁰С 15мин.
Среда Preston для выделения кампилобактерий из молока.

Состав:

Полиммиксин В 5МЕ/мл

Рифампицин 10мг/л

Триметоприм 10мг/л

Циклогексимид 0,1г/л
Среда Парка для исследования продуктов птицеводства.

Состав:

FBP – добавка

Ванкомицин 20мг/л

Триметоприм 10мг/л

Полимиксин В 500МЕ/л
Добавка для повышения аэротолерантности (FBP – добавка)

Состав:

Натрия метабисульфит 0,25г

Натрия пируват 0,25г

Навески солей внести в сухую стерильную пробирку, добавить 5 мл стерильной дистиллированной воды. Указанное количество добавок рассчитано на 1л питательной среды. Растворение солей занимает 15-20мин при периодическом встряхивании пробирки. Правильно приготовленный раствор имеет оливковый цвет. Раствор не подлежит хранению и должен быть использован в день приготовления.

40г эритрит-агара размешать в 1л дистиллированной воды, довести до кипения и кипятить до полного растворения 2-3мин. Среду разлить по 400мл, стерилизовать 121⁰С 20мин. В остуженную до 50-55⁰С питательную основу внести FBP – добавку и 20 мл бараньей, лошадиной или донорской крови. Для придания селективных свойств возмлжно использовать одну из приведенных ниже селективных смесей.

Баранью или лошадиную кровь, асептически взятую у здоровых животных, дефибринировать с помощью стеклянных бус и хранить до использования при 4⁰С в течение 7-10 дней.

Смесь антибиотиков 1.

Ванкомицин 2,0 мг

Полимиксин 0,05 мг

Триметоприм 1,0мг

на 200 мл среды
Смесь антибиотиков 2.

Цефоперазон 32,0 мг

Ванкомицин 10,0 мг

Амфотерицин В 3,0 мг

на 1000мл среды

Необходимые количества антибиотиков взвесить на весах и внести во флакон с 3,0 мл дистиллированной воды; смесь растворить при тщательном перемешивании.

Состав:

Железо II сернокислое 0,15г

Экстрат кормовых дрожжей (ЭКД) 4г

Уголь бактериологический активированный 4г

Вода дистиллированная 4г

Стерилизовать автоклавированием 121⁰С 15мин.

Допускается использование других коммерческих питательных сред, систем идентификации и диагностических препаратов, предназначенных для целей описываемых методов зарегистрированных в Республике Беларусь в установленном порядке. При их применении руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.

Приложение 1

К Инструкции 4.2. -2006

«Микробиологические методы выделения и идентификации

возбудителей при бактериальных пищевых отравлениях»