Исследование лакказной активности базидиальных грибов
Состав реакционной смеси: ООООО
жүктеу/скачать 58 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Показания оптической плотности (ОД 440
- Экстракт поверхностной культуры
- Внутриклеточный экстракт
- Ход работы : Для определения лакказной активности необходимо отсутствие мутности
- При этом показания ОД (изменения) должны находиться в области показаний значений 0,1- 0,7. Если изменения ОД (показания менее 0,1
- ─ ОД 1 )/ . t
| Состав реакционной смеси: ООООО
Условия окисления: температура, рН и ионная сила буферной смеси Таблица – Данные для определения лакказной активности
В отчете обязательно отразить условия получения препарата для анализа – скольки суточный препарат, на какой среде и каких условиях получен и др. Объем реакционной смеси с указанием объема пробы в смеси. Ход работы: Для определения лакказной активности необходимо отсутствие мутности исследуемого ферментного раствора, поэтому перед измерением необходимо пробу КЖ отфуговать на центрифуге в течение 3-5 мин при 6-8 тыс. об/мин, или КЖ отфуговать заранее и затем работу проводить с супернатантами. Для определения лакказной активности проводят реакцию трансформации раствора пирокатехина 10 мМ в 0,1М ацетатном буфере рН 5,0 с помощью культуральной жидкости (или других ферментных препаратов) микроорганизмов. В результате реакции окисления пирокатехина под действием лакказ образуются темно-окрашенные о-хиноны, образование которых фиксируют на фотоэлектроколориметре КФК. Для удобства регистрации показаний оптической плотности (ОД440) реакцию окисления проводят в стеклянной кювете колориметра КФК, объемом 3,5-4 мл. Для этого 0,1-2 мл КЖ помещают в 1-4 мл раствора пирокатехина ( концентрация 10 мМ в составе реакционной смеси) в 0,1 М ацетатном буфере рН 5,0 и этого момента отсчитывают время реакции. Измеряют ОД через 0-1-2-3-5 мин (не менее 4-5 точек) по показаниям колориметре ФЭК-2М при длине волны 440 нм и записывают данные в таблицу. При этом показания ОД (изменения) должны находиться в области показаний значений 0,1- 0,7. Если изменения ОД (показания менее 0,1) не происходят в течение 5-10 мин, то необходимо увеличить объем ферментативной пробы (КЖ или ЭПК) и заново поставить реакцию. Нулевая точка (0 мин) – это измерения оптической плотности ферментного раствор, смешанного вместо раствора пирокатехина в буфере, с дистиллированной водой в таком же объеме. После построения графика окисления пирокатехина (ОД от времени, мин) рассчитывают максимальную скорость реакции ( примерно на 1-3 мин) и ее используют в формуле для расчета лаказной активности в выражении V maх = (ОД0 ─ ОД1)/. t, Сделать вывод о лакказной активности изучаемого препарата, зависящей от времени, условий выращивания, субстратов или других факторов/добавок, исследуемых в этой работе. жүктеу/скачать 58 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||