Двуфазни системи за биосинтез на галантамин

Изследвано е влиянието на смолата Amberlite XAD-4 върху растежните и биосинтетичните характеристики на линия LaR 28 (показала най-добри биосинтетични характеристики по отношение на биосинтеза на галантамин), култивирана в колонен биореактор при включване на втората фаза на 14-ия, 21-ия и 28-ия ден от началото на култивационния процес.

Анализът на растежните характеристики на културата при включване на втората фаза в култивационния процес на 21-ия ден от началото на култивиране показва, че акумулираната биомаса се увеличава 1.25 пъти спрямо контролната проба (9.8 g/L) и достига до 12.3 g/L. Растежният индекс също се покачва с 1.46 пъти от 1.5 при контролната проба до 2.2 при пробата с включена втора фаза (Табл. 20). Другите два режима на добавяне на втора фаза не влияят на синтеза на биомаса.

Анализът на фотосинтетичните пигменти показва, че добавянето на втора фаза (на 14-ия ден и 21-ия ден) повишава и фотосинтетичния потенциал на културата при култивирането й в колонен биореактор. Общото количество на хлорофилите се повишава с 1.48 пъти – от 3.3 mg/L (2.0 mg/L хлорофил А и 1.3 хлорофил Б) при контролната проба до 4.9 mg/L (3.0 mg/L хлорофил А и 1.9 хлорофил Б) при пробата, към която е добавена втора фаза на 21-ия ден от началото на култивиране (Табл. 21). При включване на втората фаза в 14-ия ден от началото на култивиране биосинтезът на фотосинтетичните пигменти се покачва 1.39 пъти спрямо контролата.
Табл. 21. Количества фотосинтетични пигменти, биосинтезирани при двуфазно култивиране на shoot тип линия L. aestivum LaR 28, култивирана в колонен биореактор с вътрешни секции.

Ден на добавяне на втората фаза	Хлорофил А, mg/L	Хлорофил Б, mg/L
Контрола	2.0	1.3
14-ия ден	3.0	1.6
21-ия ден	3.0	1.9
28-ия ден	1.9	0.9

Максимално количество галантамин се биосинтезира при култивиране на линия LaR 28 в колонен биореактор с включена втора фаза на 21-ия ден от началото на култивационния процес – 5.9 mg/L (3.2 mg/L вътреклетъчен и 2.7 външноклетъчен). Това количество биосинтезиран галантамин е 1.78 пъти повече в сравнение с контролата (3.3 mg/L – 1.8 mg/L вътреклетъчен и 1.5 mg/L външноклетъчен) (Фиг. 21). Добавянето на втора фаза, от една страна, индуцира биосинтеза на галантамин в растителната клетка, а, от друга, увеличава секрецията му в културалната течност. Вътреклетъчният галантамин при пробата с добавена втора фаза се увеличава с 1.77 пъти (3.2 mg/L) в сравнение с контролата – 1.8 mg/L. Външноклетъчният галантамин се повишава съответно с 1.8 пъти (2.7 mg/L) в сравнение с контролата – 1.5 mg/L. 96.3% от външноклетъчния галантамин (2.6 mg/L) е адсорбиран върху втората фаза Amberlite XAD-4 и само 0.1 mg/L се отчита в културалната течност. Тези резултати показват, че при добавянето на втора фаза на 21-ия ден от началото на култивационния процес се нарушава концентрационното равновесие (клетка–среда) и клетката, от една страна, биосинтезира de novo галантамин в биомасата, а, от друга, се увеличава секрецията му в културалната течност.

За първи път е анализиран алкалоидният профил на различните части на двуфазна система за биосинтез на биологично активни вещества от растителни in vitro системи (Табл. 22). Идентифицирани са 8 алкалоида при културите с добавена втора фаза. Тези идентифицирани алкалоиди са с пет по-малко в сравнение с контролата без добавена втора фаза. Идентифициран е един нов за вида L. aestivum L. алкалоид, адсорбиран върху втората фаза – 3-О-метилноргалантамин (4). Този алкалоид е с неизвестна биологична активност. Галантаминът (3) при вътреклетъчните алкалоидни екстракти увеличава концентрациите си при пробите с добавена втора фаза при всички изследвани режими. При режим на добавяне на 14-ия и 21-ия ден от началото на култивационния процес галантаминът е единственият алкалоид, идентифициран във вътреклетъчните алкалоидни екстракти, а при 28-ия ден е 98.8% от общия йонен ток. Галантаминът е единственият алкалоид, наличен в алкалоидните екстракти на културалната течност при трите режима на култивиране. Тези резултати показват, че добавянето на втора фаза в процеса на култивиране насочва вторичния метаболизъм на културата към биосинтез на галантамин. Наличието само на галантамин в културалната течност показва, че той изпълнява защитни функции за клетката. 3-О-метилгалантаминът (4) се идентифицира в алкалоидната фракция, адсорбирана върху втората фаза (5.2% от общия йонен ток), само при режим на добаянето й на 14-ия ден. Прекият предшественик на галантамина – норгалантаминът (6), се идентифицира само адсорбиран върху втрората фаза при добавянето й на 21-ия ден от началото на култивационния процес. 8-О-деметилмаритидин (9) – вторият по концентрация алкалоид във вътреклетъчните алкалоидни екстракти, идентифициран в контролната проба, не се открива в алкалоидните екстракти при добавяне на втората фаза на 14-ия и 21-ия ден. Този алкалоид се отчита само във вътреклетъчните алкалоидни екстракти при добавяне на втората фаза на 28-ия ден от началото на култивационния процес (1% от общия йонен ток) и адсорбиран върху втората фаза при добавянето й на 21-ия ден (2.5% от общия йонен ток). Витатин (7) се идентифицира само адсорбиран върху втората фаза при добавянето й на 14-ия (4.1% от общия йонен ток) и 21-ия ден (2.9% от общия йонен ток) и не се открива във вътреклетъчните алкалоидни екстракти (Табл. 22).

В заключение добавянето на втора фаза в процеса на култивиране на линия LaR 28 в колонен биореактор с вътрешни секции насочва алкалоидния метаболизъм към синтез на галантамин и инхибира синтеза на алкалоиди от хемантаминов и ликоринов тип. Това е добра база за използването на двуфазния метод на култивиране на shoot култури от L. aestivum като промишлена продукционна система.

На база на резултатите от дългогодишните изследвания в Лабораторията по Промишлени биотехнологии–Пловдив към Института по микробиология–БАН и изследванията в настоящата дисертация предлагаме следния интегриран подход за получаване на галантамин от растителни in vitro системи на Leucojum aestivum L. (Фиг. 22)

Ключов етап от представената технологична схема са перманентната селекция на високопродуктивни линии, адаптирането на дизайна на култивационните системи и in situ екстракцията на целевия метаболит.

Селекция на високопродуктивни линии. В резултат от проведените експерименти по получаване и селекция на in vitro системи са получени shoot органови култури, различаващи се в значителна степен както по растежните си характеристики, така и по биосинтетичния си потенциал по отношение на продукцията на галантамин. Селекционирана е shoot култура Leucojum aestivum L. LaR 28 и е определена като най-перспективна in vitro система – продуцент на галантамин (332.3 μg/g СБ).

Базирайки се на изменчивостта на вторичния метаболизъм на културите от калусните системи, ние твърдим, че перспективното прилагане на разработения селекционен алгоритъм би довело до значителни ползи за технологичните процеси.

Резултатите от проведения експеримент по елиситиране показват, че елиситирането е ефективен подход за оптимизиране на биосинтез на галантамин и е задължителен етап от една бъдеща технология за получаването му. Важни етапи за осъществяване на ефективно елиситиране са експерименталното установяване на вида елиситор, неговата концентрация и времето му на добавяне към култивационната система.

1* Качествен и количествен анализ – HPLC, GC-MS; антиацетилхолинестеразна активност.

2* 10 сек. 70% етанол, 15 мин. 7% р-р CaCl(ClO), промиване с дестилирана вода.

3* MS хранителна среда с добавени 2.0 mg/L 2,4-D и 0.1 mg/L Кинетин; температура 26°С на тъмно.

4* MS хранителна среда с добавени 1.15 mg/L NAA 2.0 mg/L BAP температура 26°С; фотопериод 16 h на светло/ 8 h на тъмно.

5* Качествен и количествен анализ – HPLC, GC-MS; антиацетилхолинестеразна активност.

6* MS хранителна среда с добавени 1.15 mg/L NAA 2.0 mg/L BAP; температура 26°С; фотопериод 16 h на светло/ 8 h на тъмно

7* Инокулум - 60 g/L свежа биомаса; температура 22°С, дебит на входящия въздух 18 L/(L.h), фотопериод 16 h на светло/ 8 h на тъмно; 35 дни.

7а* 40μМ жасмонова киселина, добавена на 28-ия ден

7б* 10 g/L Amberlite XAD-4 включена на 21-ия ден

8а* Концентриране на вакуумизпарител при 70°С.

8б* Лиофилизиране.

8в* Елуиране с 1% (0.5М HCl) метанол.

9* Следва да се разработи.

В заключение предложеният интегриран подход за получаване на галантамин от растителни in vitro системи на Leucojum aestivum L. включва използването на различни стратегии, целящи постигането на значително повишение в добива на галантамин от селекционираната in vitro система. Всяка от предложените стратегии може да доведе до значително повишение в добива на галантамин, но за разгръщане на пълния биосинтетичен потенциал на in vitro системите е необходимо тяхното комплексно прилагане. По този начин се достига максимална продуктивност на култивационната система, което е предпоставка за по-добра икономическа ефективност на процесите на биотехнологичното получаване на галантамин. Вследствие на прилагането на интегриран подход е постигнат добив от 5.6 mg/L галантамин и продуктивност на системата 168.6 μg/(L.day). Това са най-високите добиви, съобщавани понастоящем в научната литература.