Иван Георгиев Иванов биосинтез на галантамин от растителни in vitro системи на leucojum

Антиaцетилхолинестеразната активност не съвпада с количеството биосинтезиран галантамин при различните режими на култивиране (Фиг. 5 A. и Фиг. 6 A.). Най-висока антиацетилхолинестеразна активност притежават алкалоидните екстракти от биомасата (IC₅₀ 4.6 mg), получена при режим на култивиране с 15 min период на разбъркване и 8 h период на покой и 22°С. Активностите, отчетени при in vitro културите на L. aestivum, са близки по стойност на тези, получени при алкалоидните екстракти на интактни растения. За първи път са изследвани антиацетилхолинестеразните активноси на външноклетъчни алкалоидни смеси. Най-високата инхибираща активност (IC₅₀ 37.8 ml) е отчетена при режим на култивиране с 15 min период на разбъркване и 8 h период на покой при 22°С, т.е при по-ниска от оптималната температура за биосинтез на галантамин (Табл.7). Този резултат най-вероятно се дължи както на повишените концентрации на норгалантамин, така и на синергитичен ефект на миноритарните алкалоиди в комплексния екстракт (Orhan and Sener, 2003). За да дадем отговор на този въпрос, насочихме нашите изследвания към масспектроскопски анализ на алкалоидните фракции, получени при различните условия на култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в система с временно разбъркване.

В алкалоидните смеси са идентифицирани 18 алкалоида, като три от тях са мажоритарни (ликорин, галантамин и хамаин), а останалите са в минорни количества ( 1% от йонния ток) (Табл. 8).

Сигналът за ликорина (16) е най-голям процент от общия йонен ток както при външноклетъчните, така и при вътреклетъчните алкалоидни екстракти. Относителното му съдържание е между 60% и 70% от общия йонен ток при различните режими на култивиране. Галантаминът (1) е другият алкалоид с високо относително съдържание: 25%–30% от общия йонен ток. Следва да се отбележи, че относителното съдържание на галантамин във външноклетъчните и вътреклетъчните алкалоидни смеси е приблизително еднакво. Периодът на разбъркване не оказва съществено влияние върху относителното съдържание на галантамин и ликорин в алкалоидните смеси. За разлика от галантамина и ликорина, относителното съдържание на хамаина (14), третия главен алкалоид, е между 3%–5% от общия йонен ток във вътреклетъчните алкалоидни екстракти, докато количествата му във външноклетъчните е 2 пъти по ниско. Максимално количество хамаин в биомасата (5.2% от общия йонен ток) се отчита при режим с 15 min период на разбъркване и 10 h период на покой, а максимално количество в културалната течност (2.0% от общия йонен ток) се натрупва при режим с 15 min период на разбъркване и 12 h период на покой. Относителното съдържание на норгалантаминa (2), прекия предшественик на галантамина, е в по-голяма степен в биомасата, отколкото в културалната течност, а нарвединът (4) – продукт на галантамина, е в по-голямo относително количество в алкалоидните смеси, получени от културалната течност. Други идентифицирани алкалоиди в минорни количества са: 8-О-деметилмаритидин (7), идентифициран само в алкалоидните смеси, екстрахирани от боимасата, а плувин (10), норплувинацетат (8), ацетилкаранин (9), хеманатамин (13) и стернбергин (15) се откриват в алкалоидните смеси, екстрахирани от културалната течност. Алкалоидите витатин (3) и анхидроликорин (5) се откриват както в биомасата, така и в културалната течност. Тези резултати показват, че растителните shoot култури на L. aestivum са добра биологична матрица както за биосинтез на галантамин, така и за изследване на ценни за медицината и фармацията алкалоиди, притежаващи разнообразни биологични активности.

Алкалоидите, идентифицирани в L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в система с временно разбъркване, се групират в четири типа съобразно скелетната си структура и фенол-окислителното присъединяване на общия им предшественик, 4-О-метилнорбеладина: галантаминов (алкалоиди; 1, 2, 4 и 17), ликоринов (алкалоиди; 5, 8, 9, 10, 12, 15 и 16), хомоликоринов (6 и 18) и хемантаминов (3, 7, 13 и 14) тип (Фиг. 7). Ликориновият тип алкалоиди във вътреклетъчните фракции намаляват относителното си съдържание с увеличаване на честотата на разбъркване от 72.6% от общия йонен ток до 57.1% от общия йонен ток. Честотата на разбъркване практически не оказва влияние на относителното съдържание на алкалоидите от ликоринов тип във външноклетъчната фракция. Относителното съдържание във вътреклетъчните фракции на алкалоидите от галантаминовия тип обаче се влияе от периода на разбъркване – повишава се с увеличаване на честотата на разбъркване от 22.1% от общия йонен ток до 35.8% от общия йонен ток. Относителното съдържание на алкалоидите от хемантаминов тип се увеличава с нарастване на периода на покой от 3.5% от общия йонен ток (15 min период на разбъркване и 8 h период на покой) до 6.3% от общия йонен ток (15 min период на разбъркване и 10 h период на покой). По-продължителните периоди на покой благоприятстват биосинтеза на алкалоиди от галантаминов и хемантаминов тип.

Проучено е и влиянието на температурата на култивиране върху алкалоидния профил на L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в система с временно разбъркване тип RITA, при режим на култивиране с 15 min период на разбъркване и 8 h период на покой. Идентифицирани са също 18 алкалоида (Табл. 9). Галантаминът (1) и ликоринът (16) отново са алкалоидите с най-голямо относително съдържание при изследваните температури на култивиране (18, 22, 26 и 30°С). С намаляване на температурата на култивиране от 26°С на 22°С относителното съдържание на галантамин в алкалоидните екстракти от биомасата и културалната течност се увеличава 2 пъти: вътреклетъчният галантамин от 25.2% от общия йонен ток при 26°С се повишава до 59.8% от общия йонен ток, а външноклетъчният от 27.6% от общия йонен ток се увеличава до 66.3% от общия йонен ток при 22°С При температура на култивиране 22°С галантаминът е доминиращият алкалоид. Алкалоидите от галантаминов тип – норгалантамин (2), нарведин (4) и N-формилноргалантамин (17) – също увеличават относителните си концентрации както в алкалоидните екстракти от биомасата, така и в екстрактите от културалната течност при температура на култивиране 22°С. Норгалантаминът се увеличава 6.3 пъти (от 0.3% от общия йонен ток до 1.9% от общия йонен ток) при вътреклетъчните алкалоиди и 2.5 пъти (от 0.2% от общия йонен ток до 0.5% от общия йонен ток) при външноклетъчните алкалоиди. Количеството на нарведина се увеличава 1.6 пъти при вътреклетъчните и външноклетъчните алкалоиди (от 0.5% до 0.8% от общия йонен ток и от 0.7% до 1.2% от общия йонен ток), а N-формилноргалантаминът нараства от следи до 0.1% от общия йонен ток. Това значително увеличение в съдържанието на галантамина и галантаминовия тип алкалоиди корелира с най-високата отчетена антиацетилхолинестеразна активност на алкалоидните екстракти от биомасата и култyралната течност (Табл. 7). Ликоринът намалява относителното си съдържание при понижаване на температурата на култивиране от 26°С на 22°С, както следва: 2.2 пъти при вътреклетъчните (от 69.7% до 31.6% от общия йонен ток) и 2.4 пъти при външноклетъчните (от 65.5% до 26.7% от общия йонен ток). Този резултат показва, че температура на култивиране 22°С действа инхибиращо на биосинтеза на ликорин и същевременно активира биосинтеза на галантамин и само чрез промяна в условията на култивиране можем да манипулираме биосинтетичния път на Amaryllidaceae алкалиодите в посока биосинтез на галантамин.