Селекция на високопродуктивни линии

Shoot културите са получени чрез прехвърляне на калусна линия LaR 67 в среда за диференциация. Културите се субкултивират през 28-дневен период. От формирания ембриогенен калус се отделят прорастъци и се прехвърлят в нова хранителна среда. По този начин са получени 160 нови линии. В процеса на култивиране от новополучените 160 линии 108 се заразиха, 40 некротизираха и 12 линии се развиват добре – LaR 19, LaR 26, LaR 28, LaR 29, LaR 35, LaR 36, LaR 38, LaR 40, LaR, 86, LaR 92, LaR 99 и LaR 128.

Новополучените 12 линии бяха подложени на първоначален скрининг за определяне на растежните и биосинтетичните им характеристики. Растежният индекс на всички новополучени линии, освен LaR 28, е по-нисък от контролната линия G 80. Растежният индекс на линия LaR 28 (2.0) е и най-високият в сравнение с другите новоселекционирани линии и същевременно съвпада с този на контролната линия G 80.

Новоселекционираните линии биосинтезират преимуществено галантамин. Количествата акумулиран галантамин при всички новополучени линии са значително по-високи в сравнение с контролната L. aestivum G 80 (76 μg/g СБ). Най-общо новополучените линии могат да се разделят на четири групи според количеството синтезиран галантамин в биомасата:

1. Над 400 μg/g СБ – LaR 28 (449 μg/g СБ) и LaR 86 (420 μg/g СБ).

2. 300 ÷ 400 μg/g СБ – LaR 19 (328 μg/g СБ), LaR 29 (381 μg/g СБ), LaR 35 (358 μg/g СБ) и LaR 36 (350 μg/g СБ).

3. 200 ÷ 300 μg/g СБ – LaR 38 (288 μg/g СБ), LaR 92 (282 μg/g СБ), LaR 99 (230 μg/g СБ) и LaR 128 (259 μg/g СБ).

4. 100 ÷ 200 μg/g СБ – LaR 26 (135 μg/g СБ) и LaR 40 (186 μg/g СБ).

Линиите LaR 28 и LaR 86 биосинтезират между 5.5–6.0 пъти повече галантамин от линия L. aestivum G 80.

Първичният скрининг на новите линии LaR показва, че те преимуществено биосинтезират галантамин и норгалантамин (галантаминов тип алкалоиди). Като най-високопродуктивна линия се определя LaR 28, защото освен високия си биосинтетичен потенциал тя има и добри растежни характеристики, сравними с контролната линия G 80, култивирана твърдофазно.

Стабилността на биосинтетичните характеристики на продуцентите на биологично активни вещества е от особено значение за разработването на ефективни процеси за получаването им. В тази връзка проследихме растежните и биосинтетичните характеристики на новоселекционираните линии в рамките на дванадесетмесечен период. За целта бяха подбрани за изследване линии, показали най-висок растежен индекс (над 1) и висок биосинтетичен потенциал (LaR 26, LaR 28, LaR 38, LaR 86 и LaR 99) (Фиг. 18). Периодите на анализ съвпадат и с годишните сезони – пролет (3), лято (6), есен (9) и зима (12). Резултатите показват стабилност в растежния индекс на културите в проследения 12-месечен период (Фиг. 18 А). Линия LaR 28 има най-висок растежен индекс (1.42 ±0.4), следвана от LaR 26 (1.35 ±0.1), LaR 86 (1.30 ±0.1) и LaR 99 (1.30 ±0.1). LaR 38 има най-нисък растежен индекс (1.05 ±0.1) от изследваните линии. Новоселекционираните линии показват и стабилни биосинтетични характеристики по отношение на галантамина. Стандартните отклонения при отделните линии са между 20 и 70 μg/g СБ, a коефициентът на вариабилност варира от 10 до 30% (Фиг. 19). Следва да се отбележи, че през пролетния (3) и зимния (12) сезон културите биосинтезират повече галантамин в сравнение с летния (6) сезон. Това е свързано с годишния цикъл, през който преминават интактните растения в естествените си местообитания.


Фиг. 18. Растежни индекси (А) и количества акумулиран галантамин (Б) от новополучените линии L. aestivum за период от 12 месеца.


Фиг. 19. Средни стойности на биосинтезираните алкалоиди през проследения дванадесетмесечен период. *Коефициент на вариабилност (CV%).
Анализът на получените резултати показва, че линиите LaR 28, LaR 86 и LaR 99 биосинтезират в приблизително равни количества галантамин (между 310 и 380 μg/g СБ). От тях LaR 86 биосинтезира най-големи количества галантамин (379.5 μg/g СБ), следвана от LaR 28 (332.3 μg/g СБ) и LaR 99 (310.2 μg/g СБ). Линиите LaR 26 и LaR 38 биосинтезират значително по-малко галантамин – 273.0 μg/g СБ за LaR 38 и 126.2 μg/g СБ за LaR 26 (Фиг. 19). Новоселекционираните линии биосинтезират норгалантамин в значителни количества. Между отделните линии се наблюдава много малка разлика в биосинтеза на норгалантамин. Натрупаните количества са между 140 и 180 μg/g СБ. Най-голямо количество е отчетено при LaR 99 – 183.8 μg/g СБ.

В заключение новоселекционираните линии показват стабилен растежен и биосинтетичен потенциал във времето при твърдофазно култивиране. Най-високопродуктивни линии по отношение на биосинтеза на галантамин са линиите LaR 86 (379.5 μg/g СБ) и LaR 28 (332.3 μg/g СБ). Всички линии биосинтезират ликорин в незначителни количества. На база на получените резултати линии LaR 26, LaR 28, LaR 38, LaR 86, LaR и LaR 99 са определени за следващата стъпка на селекция – култивиране в модифициран колонен биореактор с вътрешни секции.

Количествата биосинтезиран галантамин от новоселекционираните линии са значително по-големи спрямо контролната линия. Максимално количество галантамин биосинтезира линия LaR 28 – 3.3 mg/L (1.8 mg/L вътреклетъчен и 1.5 mg/L външноклетъчен). Това количество биосинтезиран галантамин е 1.94 пъти повече в сравнение с контролната линия G 80 – 1.7 mg/L (1.0 mg/L вътреклетъчен и 0.7 mg/L външноклетъчен) (Фиг 20 А).

В заключение новоселекционираните линии биосинтезират значително по-големи количества галантамин в сравнение с контролната линия G 80. Най-голямо количество галантамин се биосинтезира от линия LaR 28 (3.3 mg/L) при култивирането й в колонен биореактор с вътрешни секции. Галантаминът в тази линия е 92% от общия йонен ток при външноклетъчните алкалоидни екстракти и 79% от общия йонен ток при вътреклетъчните. Тази висока чистота на биосинтезирания галантамин позволява по-евтин и бърз процес на пречистване от съпътстващите го алкалоиди. Тези резултати показват, че линия LaR 28 е подходяща биологична матрица за разработване на технологична схема за продукция на галантамин. Високите относителни концентрации на външноклетъчен галантамин определят линия LaR 28 като подходяща за разработване на двуфазен метод за биосинтеза му.