Иван Георгиев Иванов биосинтез на галантамин от растителни in vitro системи на leucojum

6. Методи за изолиране и анализ

Анализ на общи феноли. Анализът е проведен по метода на Folin–Ciocalteu.

Анализ на общи протеини. Анализът е проведен с тест кит RANDOX^®.

Количествен анализ на нитратните, амониевите и фосфатните йони. Анализът е проведен с химични тест-комбинации Spectroquant^®.

7. Използван софтуер и статистическа обработка на данните. Всички представени данни са обобщени стойности от два независими експеримента, извършени в трикратна повторяемост. Статистическият анализ и графичното оформление на получените резултати са извършени със Scientific Graph System SigmaPlot^ v.7.0 (Systat Software, Inc., USA), MINITAB 14 (Minitab Inc.), Microsoft^ Excel 2000 (Microsoft, Redmond, USA), Microsoft^ Word 2000 (Microsoft, Redmond, USA), ACD ChemSketch (Advanced Chemistry Development, Inc., Canada), NIST 08 (National Institute of Standards and Technology, USA), AMDIS v.2.68 (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, USA) и Brееzе ^ТМ 3.30 (Waters, Ireland).

За целта хроматографската система на Sellés et al. (1999) беше променена чрез моделиране на подвижната фаза (градиент и рН на неорганичния компонент) и скоростта на потока. За хроматографското разделяне е използвана колона Symmetry^® C₁₈ (150 mm x 4.6 mm, 5μm) (Waters Milford, USA). Най-добро разделяне на алкалоидите се постига, когато рН на 1% амониев ацетат (Разтвор Б) е 6.6. Наред с рН на неорганичния компонент е оптимизирано и съотношението между неорганичния и органичния компонент на подвижната фаза в началото на метода, както и градиентът на промените в това съотношение. Частта на органичната фаза (ацетонитрил) се намалява от 31% (разтвор А) на 10% и по време на разделянето се увеличава до 90% за 18 минути вместо до 70% за 10 мин. при оригиналния метод (Табл. 1). Друга съществена промяна е намалената скорост на изтичане в началните етапи на процеса на разделяне. След оптимизиране на метода се получава перфектно разделяне на стандартите на целевите алкалоиди (Фиг. 1 Б). Освен за моделни системи методът следва да е подходящ и за анализа на комплексните растителни екстракти. Получените резултати по анализа на алкалоидните фракции на L. aestivum shoot културата категорично показаха, че методът е приложим за количественото определяне на галантамина, норгалантамина и ликорина (Фиг. 2).

Резултатите от теста за възпроизводимост на резултатите, показващи надеждността на използвания HPLC метод за количествено определяне на концентрациите на изследваните компоненти, са представени на Табл. 2.

Създаденият метод за качествен и количествен контрол на алкалоидите галантамин, ликорин и норгалантамин в алкалоидни екстракти на shoot култури на L. аestivum е добра методична база за следващите изследвания от настоящата дисертация.

Влияние върху развитието на културата оказва и температурата на култивиране, поради което е анализиран процесът на култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в система с временно разбъркване, при 18°С, 22°С, 26°С и 30°С и режим на култивиране с 15 min период на разбъркване и 8 h период на покой, доколкото при този режим на разбъркване се получават максималните стойности по отношение на акумулираната суха биомаса и растежния индекс. Получените резултати показват, че най-подходящата температура на култивиране е 26°С, при която L. aestivum G 80 натрупва 2.40 g/RITA биомаса (Табл. 3). Растежният индекс (2.98) е по-висок от този, постигнат при L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в колби (2.50).

Във връзка с миксотрофния тип на хранене е изследвано влиянието на условията на култивиране върху фотосинтетичния потенциал на L. aestivum shoot линия G 80 при култивирането й в система с временно разбъркване чрез количествено определяне на фотосинтетичните пигменти хлорофил А и хлорофил Б (Табл. 4). Количеството биосинтезиран хлорофил зависи правопропорционално от продължителността на периодите на покой и не зависи от температурата на култивиране. Максимално количество хлорофил (0.85 mg/RITA – 0.46 mg/RITA хлорофил А и 0.39 mg/RITA хлорофил Б) се биосинтезира при режим с 15 min период на разбъркване, 8 h период на покой и 26°С – оптималните условия за синтез на биомаса. Следователно оптималните условия за синтеза на биомаса осигуряват и максимална експресия на фотосинтетичния потенциал на L. aestivum G 80 – факт с важно значение, защото е известно, че биосинтезът на галантамин зависи от режима на осветеност при култивирането на shoot култури от L. aestivum (Berkov et al., 2009).

Най-високата степен на усвояване на захарозата се постига, когато L. aestivum shoot линия G 80 се развива при 26°С и режим на култивиране с 15 min период на разбъркване и 8 h период на покой (Фиг. 3).

Резултатите, получени при анализа на влиянието на периода на разбъркване и температурата на култивиране върху биосинтеза на галантамин и съпътстващите алкалоиди от L. aestivum shoot линия G 80, показват значимостта на изследваните независими променливи. На база на резултатите от този анализ (Табл. 5) са изведени регресионните уравнения, описващи влиянието на периода на покой (Х₁) и температурата (Х₂) върху добива от биомаса – Y₁, галантамин – Y₂, норгалантамин – Y_3, и ликорин – Y₄: