Иван Георгиев Иванов биосинтез на галантамин от растителни in vitro системи на leucojum

При намаляване на температурата на култивиране от 26°С до 18°С степента на усвояване на основния въглероден източник (захарозата) намалява (от 44.9% до 21.9%) (Фиг. 8 А). Подобно намаление в степента на усвояване на захарозата се наблюдава и при намаляване на дебита на входящия въздух от 27 L/(L.h) до 9 L/(L.h) (от 42.4% до 26.5% съответно) (Фиг. 8 Б).

Дебитът на входящия въздух оказва значително влияние върху усвояването на основните хранителни компоненти (нитратни, амониеви и фосфатни йони) (Фиг. 9 Б). Максималната степен на усвояване съвпада с максималното натрупване на биомаса в колонния биореактор при 18 L/(L.h): съответно 62% – NO₃, 95% – NH₄, 99% – PO₄. Данните, получени относно усвояването на основните хранителни компоненти от хранителната среда, показват, че колонният биоректор с вътрешни секции покрива напълно хранителните нужди на L. aestivum shoot линия G 80.

Tемпературата на култивиране и дебитът на входящия въздух силно влияят върху биосинтеза на галантамин от L. aestivum shoot линия G 80 (Фиг. 10 и Фиг. 11). Максимално количество галантамин – 1.68 mg/L (1.04 mg/L вътреклетъчен и 0.64 mg/L външноклетъчен), сe биосинтезира в края на култивирането на L. aestivum shoot линия G 80 при режим на култивиране с температура 22°С и дебит на входящия въздух 18 L/(L.h) (Фиг. 10 А).


Фиг. 10. Влияние на температурата на култивиране върху биосинтеза на галантамин (А), ликорин (Б) и норгалантамин (В) от L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в колонен биореактор с вътрешни секции. Дебит на входящия въздух – 18 L/(L.h).
При култивирането в колонен биореактор на L. aestivum shoot линия G 80 биосинтезира и значителни количества ликорин. Температурата на култивиране и дебитът на входящия въздух оказват силно влияние върху биосинтеза на ликорин. Най-голямо количество 8.32 mg/L (6.27 mg/L вътреклетъчен и 2.05 mg/L външноклетъчен) се биосинтезира при температура на култивиране 22°С и дебит на входящия въздух 18 L/(L.h) (Фиг. 10 Б).


Фиг. 11. Влияние на дебита на входящия въздух върху биосинтеза на галантамин (А), ликорин (Б) и норгалантамин (В) от L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в колонен биореактор с вътрешни секции. Температура на култивиране – 22°С.
Условията на култивиране оказват съществено влияние и върху биосинтеза на прекия предшественик на галантамина – норгалантамина. Резултатите, получени в края на култивационния процес (Фиг. 10 В и Фиг. 11 В), показват, че максимално количество норгалантамин (1.4 mg/L – 1.05 mg/L вътреклетъчен и 0.35 mg/L външноклетъчен) се синтезира от L. aestivum shoot линия G 80 при температура 22°С и дебит на входящия въздух 9 L/(L.h).

Получените резултати при анализа на процеса на култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в колонен биореактор с вътрешни секции показват, че изследваните независими променливи (температура и дебит на входящия въздух) са значими (Табл. 12). Изведени са регресионните уравнения, описващи влиянието на температурата (Х₁) и дебита на входящия въздух (Х₂) върху акумулираната биомаса (Y₁), добива на галантамин (Y₂), добива на норгалантамин (Y₃) и добива на ликорин (Y₄).

След анализа на данните са изведени съответните регресионни уравнения:

Получените стойности на коефициентите на корелация (R) са маркер за адекватността на изведените регресионни уравнения.

Процедурата по оптимизация, проведена с MINITAB 14, дава следните оптимални нива на независимите променливи Х₁ и Х₂ за максимално натрупване на биомаса и максимален биосинтез на галантамин, норгалантамин и ликорин (Y) от L. aestivum shoot линия G 80 (Табл. 13).
Табл. 13. Оптимални стойности на изследваните независими променливи за максимален биосинтез на галантамин, норгалантамин и ликорин от L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в колонен биореактор с вътрешни секции.

Алкалоид	X1*	X2*	Ŷ*max
Галантамин	21.6°С	16.46 L/(L.h)	1.71 mg/L
Норгалантамин	21.7°С	9.00 L/(L.h)	1.40 mg/L
Ликорин	21.0°С	17.73 L/(L.h)	8.60 mg/L

X₁*, X₂* - теоретично получени оптимални нива на променливите; Ŷ*_max – теоретично изчислен максимален добив.
Разликата между теоретично изчислен добив галантамин и експериментално получения при температура на култивиране 22°С е само 0.03 mg/L–1.7%, т.е практически има съвпадение между теоретично изчисления и експериментално получения добив. Въз основа на получените експериментални данни ние предлагаме режим на култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в колонен биореактор с вътрешни секции съответно:

1. Температура на култивиране – 22°С.

2. Дебит на входящия въздух – 18 L/(L.h).

Условията на култивиране влияят и върху антиацетилхолинестеразната активност на алкалоидните екстракти (Табл. 14). С увеличаване на температурата на култивиране от 18°С до 26°С се повишава 3.7 пъти антиацетилхолинестеразната активност – от IC₅₀ 19.5 mg (при 18°С) до IC₅₀ 5.2 mg (при 26°С) – във вътреклетъчните алкалоидни екстракти и 1.7 пъти – от IC₅₀ 64.3 ml (при 18°С) до IC₅₀ 37.9 ml (при 26°С) – на външноклетъчните алкалоидни екстракти, като максимална антиацетилхолинестеразна активност се отчита при 26°С и дебит на входящия въздух 18 L/(L.h), съответно IC₅₀ 5.20 mg за алкалоидите в биомасата и IC₅₀ 37.9 ml за алкалоидите в културалната течност (Табл. 14). Дебитът на входящия въздух не оказва влияние върху антиацетилхолинестеразната активност на вътреклетъчните алкалоидни екстракти, но при външноклетъчните се наблюдава повишаване на активността 1.3 пъти, от IC₅₀ 58.9 ml (при 9 L/(L.h)) до IC₅₀ 45.0 ml (при 27 L/(L.h)).

За да изясним влиянието на минорните компоненти в комплексните алкалоидни смеси, насочихме нашите изследвания към идентифициране на тези компоненти чрез масспектроскопски анализ на алкалоидните фракции, получени при различните условия на култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в колонен биореактор (Табл. 15).

В алкалоидните смеси се идентифицират 17 алкалоида, три от тях са мажоритарни – ликорин, галантамин и хамаин, осем алкалоида са в минорни количества и шест са в следи.

Алкалоидите с най-голямо относително съдържание са галантамин (1) и ликорин (16) при изследваните температури на култивиране (18, 22, и 26°С). С намаляване на температурата на култивиране от 26°С на 22°С относителното съдържание на галантамин в алкалоидните екстракти от биомасата и културалната течност се увеличава 1.6 пъти: вътреклетъчният галантамин от 18.2% от общия йонен ток при 26°С до 29.5% от общия йонен ток при 22°С, а външноклетъчният се увеличава 1.13 пъти, от 39.7% от общия йонен ток до 45.0% от общия йонен ток. Също така алкалоидите от галантаминов тип – норгалантамин (2) и нарведин (4) – увеличават своите относителни концентрации както в алкалоидните екстракти от биомасата, така и в екстрактите от културалната течност при температура на култивиране 22°С. Норгалантаминът се увеличава 3.3 пъти (от 0.3% от общия йонен ток до 1.0% от общия йонен ток) при вътреклетъчните алкалоиди, а при външноклетъчните алкалоиди от следи до 0.1% от общия йонен ток. Нарвединът повишава своите относителни концентрации 1.5 пъти при вътреклетъчните и 1.2 пъти при външноклетъчните алкалоиди (от 0.4% до 0.6% от общия йонен ток; 1.0% до 1.2% от общия йонен ток съответно). Относителните концентрации на ликорина намаляват при понижаване на температурата на култивиране от 26°С на 22°С, както следва: 1.15 пъти при вътреклетъчните (от 74.4% от общия йонен ток до 64.2% от общия йонен ток) и 1.12 пъти при външноклетъчните (от 56.2% от общия йонен ток до 49.8% от общия йонен ток). При температура на култивиране 22°С е отчетен и максималният биосинтез на галантамин (Фиг. 10 А), но при тази температура (22°С) се постига и най-високо количество биосинтезиран ликорин (Фиг. 10 Б). Понижението на температурата на култивиране от 26°С на 22°С благоприятства биосинтеза и на двата алкалоида при култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в колонен биореактор с вътрешни секции. Намалението на относителните концентрации на ликорина в алкалоидните екстракти на биомасата и културалната течност при 22°С се дължи както на увеличените относителни концентрации на галантамин, така и на повишените относителни концентрации на съпътстващите ги минорни алкалоиди. Температурата на култивиране оказва съществено влияние и върху относителното съдържание на хамаина (14) в биомасата и в културалната течност, като по-високата температура (26°С) благоприятства биосинтеза му. Максимално количество в биомасата (4.3% от общия йонен ток) се натрупва при 26°С, докато в културалната течност най-висока концентрация (1.8% от общия йонен ток) се отчита при 22°С.

Дебитът на входящия въздух също оказва влияние върху алкалоидния профил на L. aestivum G 80, култивирана в колонен биореактор. Увеличаването на дебита от 18 L/(L.h) до 27 L/(L.h) води до повишаване на относителните концентрации на галантамин 1.32 пъти, от 29.5% от общия йонен ток до 39.0% от общия йонен ток за вътреклетъчните алкалоидни екстракти, а при външноклетъчните – 1.34 пъти, от 45.0% от общия йонен ток до 60.4% от общия йонен ток. При 27 L/(L.h) дебит на входящия въздух галантаминът е доминиращият алкалоид в извънклетъчните алкалоидни екстракти. Ликоринът при увеличаване на дебита входящ въздух от 18 L/(L.h) до 27 L/(L.h) понижава своите относителни концентрации спрямо общия йонен ток – при вътреклетъчните алкалоидни екстракти намалява от 64.2% от общия йонен ток до 49.0% от общия йонен ток (1.3 пъти), а при външноклетъчните алкалоиди – от 49.8% от общия йонен ток до 31.7% от общия йонен ток (1.57 пъти).