Иван Георгиев Иванов биосинтез на галантамин от растителни in vitro системи на leucojum

При култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в двете култивационни системи са идентифицирани 18 алкалоида. Сравнителната характеристика в алкалоидния профил на двете култивационни системи при оптималните условия за биосинтез на галантамин показва, че относителното съдържание на галантамин в алкалоидните екстракти от биомасата и културалната течност в колонния биореактор е по-голямо в сравнение с относителното съдържание на галантамин в култивационната система с временно разбъркване: при вътреклетъчните относителното съдържание на галантамин е 1.17 пъти повече (25.2%) от общия йонен ток (култивационна система с временно разбъркване) – 29.5% от общия йонен ток (колонен биореактор); при външноклетъчните алкалоиди в колонен биореактор относителното съдържание на галантамин е 1.63 пъти повече (26.6%) от общия йонен ток (култивационна система с временно разбъркване) – 45.0% от общия йонен ток (колонен биореактор).

В заключение получените резултати категорично показват, че модифицираният колонен биореактор с вътрешни секции е по-подходяща система за биосинтез на галантамин от L. aestivum in vitro shoot култури.
3. Елиситиране
Проведени са експерименти по елиситиране на L. aestivum shoot линия G 80 с използване на два елиситора – метил жасмонат и жасмонова киселина.
3.1. Влияние на вида на елиситора върху развитието на L. aestivum shoot линия G 80 и добива на галантамин
Добавянето на метил жасмонатът и жасмоновата киселина в началото на експоненциалната фаза (28-ия ден) на развитие на културата стимулира синтеза на биомаса (Фиг. 12 А). 24 h след добавянето на 25μМ метил жасмонат и жасмонова киселина количеството биомаса се увеличава спрямо контролната неелиситирана проба съответно 1.32 пъти (2.47 g/колба) за метил жасмоната и 1.26 пъти (2.36 g/колба) за жасмоновата киселина (Фиг. 12 А). Независимо от началното увеличение на биомасата на 29-ия ден, до 35-ия ден на култивиране количеството натрупана биомаса не се променя и е съизмеримо с това при контролните проби – 2.50 g/колба (Фиг. 12 А).




Фиг. 12. Динамика на развитие(А), биосинтез на галантамин (Б) и изменение на ензимните активности на тирозин декарбокслазата (В) и фенилаланин амоняк лиазата (Г) при елиситиране с 25μM метил жасмонат и жасмонова киселина, добавени на 28-ия ден от култивирането на L. aestivum shoot линия G 80. Представените резултати са средни стойности ± SD.

Забележка: Представените резултати по отношение на алкалоидните добиви представляват общото количество (вътреклетъчни+външноклетъчни) алкалоиди, биосинтезирани в работния обем от 200 ml.
Максимални добиви от галантамин се получават при елиситиране с жасмонова киселина, прибавена на 28-ия ден от началото на култивирането. Максимални количества галантамин 226.9 μg/колба се отчитат 168 h след прибавяне на елиситора. Това е 1.36 пъти повече в сравнение с контролата (Фиг. 12 Б).

Добавяне на 25μМ метил жасмонат и жасмонова киселина в началото на стационарната фаза (35-ия ден) не повлиява биосинтеза на галантамин (Фиг. 13 Б).

В заключение резултатите от проведените експерименти показват, че жасмоновата киселина е по-подходящият елиситор. Най-висок добив (226 μg/колба) от галантамин се получава 168 h след добавянето, по време на експоненциалната фаза на развитие (28-ия ден от началото на култивиране) на биологичната система.

Фенилаланин амоняк лиазата и тирозин декарбоксилазата са двете ключови ензимни активности, катализиращи първото стъпало от метаболитния път на Amaryllidaceae алкалоидите, водещи до двата предшественика – канелената киселина и тирамина. Метил жасмонатът, добавен в началото на експоненциалната фаза (28-ия ден), индуцира експресията на двата ензима в първите 24 h след добавянето му – над 2 пъти за тирозин декарбоксилазата и над 3.2 пъти за фенилаланин амоняк лиазата (Фиг. 12 В и Г). Това е и първопричината за по-високия добив от изследваните алкалоиди 24 h след прибавянето на елиситора (Фиг. 12 Б). В процеса на култивиране в следващите 72 h (32-ия ден) активността на тирозин декарбоксилазата в елиситираните проби силно намалява от 12.5 U/g СБ до 4.9 U/g СБ, което е и 2 пъти по-ниско в сравнение с контролата (32-ия ден) (Фиг. 12 В), а при фенилаланин амоняк лиазата е налице засилена индукция, като повишена активност се отчита до 168-ия h след добавянето на елиситора (35-ия ден) (Фиг. 12 Г). При елиситиране с жасмонова киселина тирозин декарбоксилазата се индуцира и увеличава активността си спрямо контролата до 168-ия h от добавянето на елиситора. Максимална активност 17.7 U/g СБ се отчита на 96-ия h и тя е около 2 пъти по-висока в сравнение с контролата (Фиг. 12 В). Елиситирането с жасмонова киселина не повлиява активността на фенилаланин амоняк лиазата до 96-ия h след добавянето на елиситора, но между 96-ия и 168-ия h активността се покачва около 1.9 пъти спрямо контролата (Фиг. 12 Г). Този факт обяснява повишените добиви от изследваните алкалоиди при елиситирането с жасмонова киселина 168 h след добавянето й (Фиг. 12 Б).

Като част от клетъчния отговор е анализирано влиянието на елиситора върху биосинтеза на фенолните киселини, които участват в защитните системи на растителната клетка (Фиг. 14). Използването на метил жасмоната като елиситор, добавен в началото на експоненциалната фаза (28-ия ден), води до 5-кратно увеличение в концентрациите на канелената киселина спрямо контролната неелиситирана проба (от 2.6 μg/колба до 13.9 μg/колба) през първите 24 h след елиситирането, дължащо се на трикратното увеличение в активността на фенилаланин амоняк лиазата (Фиг. 14 А и Фиг. 12 Г) през този период. Концентрациите на този прекурсор остават по-високи от контролата до 168-ия h след добавянето на елиситора. Следващата киселина в метаболитния път – р-кумаровата, увеличава концентрациите си между 24-ия и 96-ия 1.3 пъти (от 39.6 μg/колба до 52.0 μg/колба) (Фиг. 14 Б). Тези високи концентрации от р-кумарова киселина водят до увеличение на концентрациите на следващата киселина в метаболитния път – кафеената. Тя увеличава концентрациите си между 96-ия и 168-ия h след добавяне на елиситора 3.7 пъти спрямо контролната проба (от 42.3 μg/колба до 157.9 μg/колба) (Фиг. 14 В). Феруловата киселина, от своя страна, увеличава концентрацията си до 168-ия h след началото на елиситирането над 9 пъти (от 22.8 μg/колба до 205.9 μg/колба) (Фиг. 14 Г). Феруловата киселина е предшественик на ванилиновата, синаповата и сиринголовата киселина. С този факт може да се обясни увеличението в концентрациите при синаповата киселина (1.36 пъти) и сиринголовата киселина (2 пъти) (Фиг. 14 Д и З) спрямо контролата на 168-ия h. Увеличение в концентрациите при 168-ия h след елиситирането се наблюдава и при деривата на кафеената киселина – хлорогеновата киселина (над 2.3 пъти) (Фиг. 14 Ж), и при деривата на канелената киселина – 2-хидроксибензоената (салицилова) киселина (1.7 пъти) (Фиг. 14 И). Тези резултати ни показват, че добавянето на метил жасмонат в експоненциална фаза (28-ия ден от началото на култивиране) води до координирана индукция на ензимите от фенилпропаноидния метаболитен път, като в най-голяма степен се индуцират ензимите, участващи в биосинтеза на ферулова киселина: (C4H) канелена киселина 4-хидроксилаза, (C3H) р-кумарат 3-хидроксилаза и (COMT)-кафеолил О-метилтрансфераза от фенилпропаноидния път.

Метаболитният отговор в биосинтеза на фенолни киселини при добавяне на метил жасмоната в началото на стационарната фаза (35-ия ден) е много по-слаб. Наблюдава се увеличение в концентрациите само на р-кумаровата киселина (2.8 пъти на 168-ия h) и салициловата киселина (1.6 пъти на 96-ия h). Добавянето на метил жасмонат на 35-ия ден индуцира само ензимите в началото на фенилпропаноидния метаболитен път – (C4H) кафеена киселина 4-хидриксилаза и BA2H бензоена киселина 2-хидроксилаза.

Анализът на резултатите при елиситиране с жасмонова киселина показват, че добавянето й в експоненциална фаза (28-ия ден) оказва много слаб ефект върху биосинтеза на фенолна киселина поради слабата индукция на фенилаланин амоняк лиазата в първите 96 h след добавянето на елиситора (Фиг. 14). При следващото увеличение на активността на фенилаланин амоняк лиазата, между 96-ия и 168-ия h, се увеличават и концентрациите на канелената киселина (2.6 пъти на 168-ия h). Другите изследвани киселини са в по-ниски или сравними с контролата концентрации. Елиситирането с жасмонова киселина на 35-ия ден от култивирането води до по-високи концентрации на биосинтезираната канелена киселина в първите 24 h (2.5 пъти) и тази тенденция се запазва до 168-ия h. През първите 24 h се повишават и концентрациите на биосинтезираната ванилинова киселина – 1.8 пъти, и синапова киселина – 1.14 пъти. Синаповата киселина увеличава значително (2.8 пъти) концентрациите си между 24-ия и 96-ия h.

Сравнителният анализ на получените резултати за влиянието на елиситора върху цялостния вторичен метаболизъм на L. aestivum shoot линия G 80 показва, че при елиситиране с жасмонова киселина както в началото на експоненциалната фаза (28-ия ден), така и в началото на стационарната фаза (35-ия ден) се индуцира активността преимуществено на тирозин декарбоксилазата и в по-малка степен на фенилаланин амоняк лиазата. Това води до увеличение на концентрациите на биосинтезираните алкалоиди, респективно на галантамина (Фиг. 15 Б). Метил жасмонатът, от своя страна, индуцира преимуществено транскрипцията на фенилаланин амоняк лиазата в проследения период и в по-малка степен на тирозин декарбоксилазата. Това води до биосинтез предимно на фенолни киселини, защото канелената киселина се насочва към фенилпропаноидния метаболитен път (Фиг. 15 А). Механизмите за генна регулация при двата ензима не са свързани, защото се повлияват по различен начин от различните елиситори. Необходими са следващи задълбочени изследвания за изясняване на взаимодействията на жасмоновата киселина и метил жасмоната със сигналната система, включваща се в отговор на стресови състояния в растителната клетка – калций/калмодолин и протеиновото фосфорилиране/дефосфорилиране, и индуцирането, и експресията на тирозин декарбоксилазните и фенилаланин амоняк лиазните гени, така също и на другите гени, участващи в биосинтетичния път на Amaryllidaceae алкалоидите.

В заключение жасмоновата киселина е по-подходящият елиситор за индуциране на биосинтеза на галантамин. Най-подходящото време на добавянето му е в началото на експоненциалната фаза (28-ия ден) при продължителност на последващия период на култивиране от 168 h или до началото на стационарната фаза (35-ия ден), защото при този режим се отчита и максимално увеличение (1.36 пъти) в концентрациите на галантамина спрямо контролата. Това е вследствие на увеличена експресия предимно на гена на тирозин декарбоксилазата, водещ до биосинтез на по-високи концентрации тирамин.

Максимален добив от галантамин (287.9 μg/колба) се постига 168 h след елиситиране на L. aestivum shoot линия G 80 с 40μМ жасмонова киселина, добавена в началото на експоненциалната фаза (28-ия ден) (Фиг. 16 Б). Това е 1.72 пъти по-висок добив от този при контролния вариант. Този положителен резултат се дължи на повишената активност (2 пъти) на тирозин декарбоксилазата 96 h след добавянето на елиситора (Фиг. 16 В). Високата експресия на тирозин декарбоксилазата позволява биосинтеза на достатъчни количества тирамин, което, от своя страна, води до увеличен биосинтез на алкалоидите. Повишаването на ензимната активност (2 пъти) спрямо контролата е в синхрон със степента на повишаване на добива от галантамин – 1.72. Активността на фенилаланин амоняк лиазата при елиситиране с 40 μМ жасмонова киселина се покачва 2.2 пъти през първите 24 h спрямо контролата, но в продължение на култивационния процес до 168-ия h активността спада до нива, сравними с контролната неелиситирана проба (около 65-75 U/g СБ) (Фиг.16 Г).

Добавянето на 40μМ жасмонова киселина в началото на стационарната фаза (35-ия ден) индуцира синтеза на галантамин и неговите концентрации се увеличават 1.6 пъти (257.7 μg/колба) след 24 h култивиране спрямо контролата (160.8 μg/колба) (Фиг. 17 Б). Този добив обаче е 11% по-нисък от добива, получен при прибавянето на 40 μМ жасмонова киселина на 28-ия ден от началото на култивиране – 287.9 μg/колба. При всички други изследвани концентрации на жасмонова киселина и периоди на култивиране количеството на биосинтезирания галантамин е сравнимо или по-ниско от това на контролните неелиситирани проби.

В заключение 40 μМ жасмонова киселина, индуцираща в максимална степен биосинтеза на галантамин – 287.9 μg/колба (1.72 пъти повече спрямо контролата), когато е добавена в началото на експоненциалната фаза на развитие (28-ия ден), периодът на култивиране е 168 h. При тази концентрация и време на добавяне на елиситора тирозин декарбоксилазата се експресира в максимална степен и нейната активност е най-висока (19.0 U/g СБ), което, от своя страна, обезпечава и насочването на вторичния метаболизъм към биосинтез на алкалоиди.

В заключение при изследване на влиянието на два абиотични елиситора – метил жасмонат и жасмонова киселина – върху вторичния метаболизъм на L. aestivum shoot линия G 80 е установено, че метил жасмонатът индуцира преимуществено ензима фенилаланин амоняк лиаза и насочва метаболизма към бииосинтез на фенолни киселини, а жасмоновата киселина индуцира преимуществено тирозин декарбоксилаза и пренасочва вторичния метаболизъм на растителните клетки към биосинтез на Amaryllidaceae алкалоиди. Максимално индуциране на галантаминов биосинтез е постигнато 168 h след добавяне на 40μМ жасмонова киселина в експоненциалната фаза на растеж на културата (28-ия ден) – 1.72 пъти по-висок добив в сравнение с контролата. Анализът на алкалоидния профил на елиситираните проби показа индукция в биосинтеза на миноритарните алкалоиди както в биомасата, така и в културалната течност. При елиситирането с жасмонова киселина се увеличават в голяма степен алкалоидите с para-para' фенол-окислителна структура – хемантаминовият тип. Тези резултати показват, че елиситирането, като част от цялостен технологичен процес, е преспективна стратегия за увеличаване на добивите на галантамин от shoot култури на L. aestivum.