Изучение свойств ферментного комплекса МДГ-ГОАТ

В Институте молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина в лаборатории структуры и регуляции ферментов был открыт новый ферментный комплекс, состоящий из малатдегидрогеназы и глютаматоксалоацетат-аминотрансферазы.

Авторами была постулирована следуящая последовательность реакции катализруемых ФК: сначала МДГ окисляет малат с помощью кофермента НАД до оксалоацетата, при этом кофермент НАД восстанавливается до НАДH. Затем ГОАТ осуществляет реакцию переаминирования глютамата с оксалоацетатом, образуя при этом аспартат и 2-оксоглютарат. Особо следует отметить, что в ходе этой реакций расщепление глютамата происходит без выделения аммиака, которое имеет место при расщеплении глютамата глютаматдегидрогеназой.
Очистка ФК МДГ-ГОАТ из пшеницы

Для определения размерности генов кодирующих ФК в первую очередь необходимо было получить гомогенный препарат ФК.

Схема очистки ферментного комплекса включала следующие этапы: гомогенизацию, центрифугирование, осаждение сульфатом аммония (30-70%), обессоливание на сефадексе G-50, ионообменная хроматография на ДЕАЕ целлюлозе, DE-52 и гель-хроматография на колонке с Сефакрилом S-300.

Ферментный комплекс выделяли из сухих семян пшеницы сорта Казахстанская-10. Для выделения ФК навеску 10 г размолотого зерна пшеницы тщательно растирают в 0,05М трис-HCl буфере, рН 7,5 взятом в соотношении 1:4, (вес к объему), затем гомогенат центрифугируют при 10 000хg в течение 20 минут. Полученную надосадочную жидкость освобождали от низкомолекулярных примесей в том числе и от эндогенных субстратов гель-хроматографией на колонке с Сефадексом G-50, размером (3,5x20см). Затем фракции, содержащие активность ФК, наносят на колонку с ДЭAЭ-целлюлозой типа DE-52, предварительно уравновешенную буфером для выделения, размером (5х2 см), Фирма Ваттман (Англия).

Для удаления не связавшихся белков колонку элюируют стартовым буфером. После удаления балластных белков проводят ступенчатую элюцию сначала 0,1М NaCl в том же буфере и затем 0,5М NaCl, который элюировал ФК с колонки (рисунок 1).

Фракции пика содержащей активностью ФК после ионообменной хроматографии наносили на колонку с Сефакрилом S-300 с размером колонки (2х95см).

Хроматографическое разделение контролировалось прибором Uvicord SU, 2238, LRB (рисунок 2).

Рисунок 1 - График элюции белка из пшеницы сорта Казахстанская-10 на колонке с ДЕАЕ типа ДЕ-52

Таким образом, ФК катализирует реакции, который носит катаболический характер для глютамата и анаболический характер для аспартата. Изучая совокупность реакции, катализируемых ФК можно придти к выводу о том, что ФК катализирует новый эффективный путь синтеза аспартата в растениях.

По известным молекулярным массам определяют их логарифмы и строили калибровочный график. Активность ФК выходила во фракции в соответствующей молекулярной массе 110 кДа, как это было установлено гель-хроматографии на той же колонке белков-метчиков с известными молекулярными массами. Для построения калибровочного графика использовались белки с молекулярными массами: ферритин - 440 кДа, каталаза - 232 кДа, лактатдегидрогеназа - 140 кДа, ферментный комплекс - 110 кДа, алкогольдегидрогеназа - 73 кДа, гемоглобин - 64 кДа, цитохром - 12,3 кДа.

Были изучены основные физико-химические свойства ФК из пшеницы. В первую очередь был проведен SDS-электрофорез по Laemmly (1970). Электрофорез проводился с присутствием белков-метчиков с известными молекулярными массами. Определение молекулярной массы показало, что ФК состоит из двух гетерологичных субъединиц с молекулярными массами 60 кДа и 50 кДа соответственно.

Из данных литературы известно, что все известные МДГ имеют размер полипептидной цепи равной 60 кДа из этого можно сделать вывод о том, что полипептид с молекулярной массой 60 кДА относится к МДГ, а 50 кДа относится к ГОАТ.

Таким образом, гены ФК кодируют две полипептиды 60 кДа и 50 кДа. Мы можем сделать вывод о том, что эти гены находятся рядом так, как продукт генов ФК является единым.

Одним из самых интересных вопросов явилось изучить особенности ФК у растений, различающихся в эволюционном плане. Мы провели изучение ФК в водорослях, грибах, мхах, хвощах, плаунах, папоротниках, и голосемянных растениях, таких как сосна, ель и кедр. Ни в одном из этих эволюционно старых растений обнаружить ФК нам не удалось. Мы так же не обнаружили активность ФК ни в семенах, ни в проростках лилии, которая является одним из первых цветковых растений на Земле. Также ФК не было обнаружено в микроорганизмах и в клетках животных. Это говорит о том, что ФК имеется только у эволюционно молодых высших растениях.

Однако, небольшая активность ФК была обнаружена в розоцветных - яблоках и грушах, сравнительно высокая активность ФК была обнаружена в бобовых - горохе и фасоли, и высокая активность ФК была обнаружена в тыквенных и злаковых растениях, как это видно из таблицы 2.

Полученные результаты говорят о том, что ФК является эволюционно молодым белковым комплексом, и о возможности использования активности ФК для установления эволюционных взаимоотношений различных семейств растений.

До настоящего времени активность ФК изучалась только в покоящемся семени пшеницы, и поэтому было необходимо изучить активность ФК при различных фазах морфогенеза.

Поэтому сначала была изучена активность ФК при прорастании семян различных злаковых культур: пшеницы, ячменя, кукурузы и риса. Было установлено, что активность ФК повышается в 2 раза в зародыше пшеницы уже на 6 час прорастания и остается на высоком уровне в течение 4-х суток.

В то время как в эндосперме зерна пшеницы активность ФК меняется незначительно, эти данные говорят о важной роли ФК в энергетическом обеспечении быстро растущего зародыша.

Наиболее существенные изменение в активности ФК связаны с фазой созревания семян. Было изучено активность ФК в стеблях, листьях, колосковых чешуях и семенах пшеницы сорта “Арай" по мере их созревания (Таблица 3).

Как видно из таблицы 3 для фазы формирования и налива зерна характерны очень высокая активность ФК для всех органов. А уже в фазы молочно-восковой и полной спелости зерна происходит уменьшение активности ФК в стеблях, листьях и колосковых чешуях, тогда как в семенах она остается высокой.

Таблица 3 – Активность ФК по органам в 3-х фазах созревания (молочной - I, молочно-восковой – II и полной спелости - III) пшеницы сорта “Арай”

Таблица 4 – Активность ГДГ по органам в 3-х фазах созревания (молочной - I, молочно-восковой – II и полной спелости - III) пшеницы сорта “Арай”

Из таблицы 4 становится, очевидным, что активность ГДГ, которая до нашего исследования считалось основным ферментом обмена глютамата в сотни раз меньше активности ФК. Это говорит о том, что ФК, а не ГДГ играет первостепенную роль в азотном обмене злаковых культур.

Полученные результаты свидетельствует об очень важной роли ФК в процессах формирования и налива зерна и об её важной роли мобилизации и оттока ассимилятов из ассимилирующих органов в созревающее зерно в этот очень важный период жизни растении. Об этом также свидетельствует высокая активность ФК в зерне на протяжении всей фазы созревания. Аналогичная картина была получена при изучении активности ФК в ходе созревания ячменя. Таким образом, активность ФК коррелирует с наиболее важными фазами в онтогенезе растении и в первую очередь они связаны с фазами прорастания и созревания семян злаковых культур.

Учитывая важную роль ФК в катаболизме глютамата и синтезе аспартата, явилось очень важным изучить связь активности ФК с жизнеспособностью семян пшеницы.

Для этого были взяты семена двух сортов пшеницы с различной всхожестью, так семена пшеницы сорта «Дербес» имели всхожесть- 96%, а семена пшеницы сорта Опакс -14 %.

Анализировались 7-дневные проростки изучаемых сортов пшеницы. Активность ФК определялась отдельно в корешках и колеоптилях. Было показано, что активность ФК, выраженная в мкМ-лях NADH на мл бесклеточного экстракта была равна для стебля и корешка сорта «Дербес», соответственно 166 мкМ на мг/белка и 152 мкМ на мг/белка, а для сорта «Опакс» 80 мкМ на мг/белка и 66 мкМ на мг/белка. Как видно из приведенных данных более жизнеспособный сорт «Дербес» имел активность в 2 раза выше, чем менее жизнеспособный сорт «Опакс».

Таким образом, можно сделать предположение о том, что активность ФК в определенной степени может служить диагностическим признаком для отбора жизнеспособных семян злаковых культур.
Изучение активности ФК МДГ-ГОАТ генотипов злаковых культур различающихся по солеустойчивости

Ранее нами была установлена, важная роль ФК в азотном и энергетическом метаболизме злаковых культур. Из этого следует, что этот очень важный ферментный комплекс должен играть немаловажную роль в процессах адаптации злаковых культур к абиотическим и биотическим стрессовым факторам.

Известно, что при стрессовых условиях в растениях резко усиливаются катаболические процессы. До настоящего времени, считалось, что основным ферментом катаболизма глютамата является ГДГ. Этот фермент при стрессах играет отрицательную роль, так как одним из продуктов её реакции является аммиак. Накопление токсического аммиака приводит к деструкции клеточных мембран.

Поэтому задачей нашего исследования явилось изучение активности ФК МДГ-ГОАТ генотипов злаковых культур различающихся по солеустойчивости.

Здесь на первый план выдвигается ФК, который осуществляет катаболизм глютамата без выделения токсического аммиака. Поэтому крайне целесообразным явилось, впервые изучить активность этого фермента у генотипов различающиеся по устойчивости к ионному стрессу, что откроет пути для понимания процессов адаптации растений к засолению.

С этой целью нами было проведено изучение солеустойчивости генотипов злаковых культур. Из них: 12 сортов пшеницы (Triticum aestivum L.) – Казахстанская-10, Казахстанская-16, Казахстанская-126, Толкын, Надежда, Мирас, Арай, Дауыл, Стекловидная-24, Нуреке, Саратовская-29, Ырыс;

-14 сортов ячменя (Hordeum vulgare L.) – Иран-4470, Би-10, Бота, Дигаплоид, Арна, Унумли арпа, Асем, Жулдыз, Юбилейная, Табыс, Сауле, К1-42, Байшешек Одесская-100;

-12 константных генетических линий ячменя – Б3 класс 54, Б2 класс 96, Б1 класс 71, Б7 класс 87, Б2 класс 40, Б4 класс 99, Б2 класс 84, Б8 класс 62, Б1 класс 1, Б4 класс 55, Б4 класс 13, Б4 класс 51;

-8 сортов риса (Oryza Sativa L.) - Кубань, Маржан, Аналог, Мадина, Алакольский, Солнечный, Пак-ли, Заря. Результаты исследования таблицах 5-7.

Определение солеустойчивости изучаемых генотипов осуществляли следующим образом. Семена изучаемых злаковых культур замачивали по вариантам в следующих растворах: 1 – Н₂О (контроль); 2 - 1,5% или 2% NaCl (хлоридное засоление); 3 - 1,5% или 2% Na₂SO₄ (сульфатное засоление); 4 - 1,5% NaCl с 1,5% Na₂SO₄ (хлоридно-сульфатное засоление). Эти соли были выбраны потому, что они являются характерными для Казахстана, в особенности для Аральского региона.

Как видно из таблицы 5, следующие сорта пшеницы – “Дауыл”, “Толкын”, “Арай” являются солеустойчивыми, а “Саратовская-29” и “Казахстанская-10” являются чувствительными к засолению. Как видно из таблиц следующие сорта пшеницы – “Дауыл”, “Толкын”, “Арай” являются солеустойчивыми, а “Саратовская-29” и “Казахстанская-10” являются чувствительными к засолению.

Была выполнена такая же процедура определения солеустойчивости сортов и константных линии ячменя, которая позволила установить, что сорта ячменя – “Иран-4470”, “Би-10” и константные линии ячменя – “Б1 класс 1”, “Б4 класс 51”, “Б8 класс 62”, “Б3 класс 54” и “Дигаплоид” являются солеустойчивыми, а сорта “Бота” и “Aрна” и линии “Б2 класс 96”, “Б7 класс 87”, “Б2 класс 84” являются чувствительными к засолению.

Соответственно для риса сорт “Маржан” является солеустойчивым, а сорт “Кубань” - чувствительным к засолению.

После того как были отобраны наиболее и наименее солеустойчивые генотипы злаковых культур, мы смогли перейти к изучению уровня активности ФК у сортов пшеницы различающихся, по солеустойчивости.

Результаты этих исследовании по изучению активности ФК у сортов пшеницы различающихся, по устойчивости к солевому стрессу представлены в таблице 8.

Таблица 8 – Активность ФК МДГ-ГОАТ у генотипов пшеницы различающихся по устойчивости к солевому стрессу

Как видно из таблицы 8 у устойчивых сортов пшеницы в условиях солевого стресса происходит резкое возрастание активности ФК, тогда как у не солеустойчивых сортов такое увеличение активности не наблюдается. Эти результаты говорят о важной роли ФК в процессах активной адаптаций растений к солевому стрессу. Эти результаты необходимо было проверить на другом виде растений. С этой целью были взяты различные сорта ячменя и риса, различающиеся по солеустойчивости. Результаты представлены в таблицах 9 и 11.

Таблица 10 – Активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов риса, различающихся по солеустойчивости

Результаты таблиц 9 и 10 однозначно подтверждают главную особенность того, что именно генотипы с высокой устойчивостью к засолению обладают свойством увеличивать активность ФК, тогда как не устойчивые генотипы такой способностью не обладают. Эти данные еще раз подтвердили наш вывод о роли ФК в процессах адаптации растений к засолению. Теперь, можно с уверенностью говорить, о том, что активность ФК связано с устойчивостью генотипов к засолению и кроме того повышение активности ФК играет большую роль при адаптации определенных генотипов злаковых культур к этому стрессовому фактору.

Теперь легко можно объяснить причину этой роли, она заключается в том, что при повышении активности ФК катаболизм глютамата сдвигается в сторону нетоксического пути расщепления глютамата, то есть он идет без выделения токсического аммиака, и поэтому устойчивые генотипы в меньшей степени повреждаются от токсического аммиака. С другой стороны накопление аспартата при увеличении активности ФК также благотворно сказывается на метаболизме растений, так как известно, что аспартат служит источником для биосинтеза различных аминокислот и пуринов, что также повышает адаптационную способность растения.

Таким образом, нами установлено, что ФК является одним из важнейших ферментов азотного обмена играющий очень важную роль в обеспечении жизнеспособности растений и их устойчивости к солевому стрессу.

В свете полученных результатов интересным явилось изучить активность ФК у сортов ячменя, различающихся по устойчивости к другому абиотическому фактору–высокой температуре. Известно, что в Казахстане очень часто выращивание злаковых культур имеет место в регионах подверженных действию высоких температур. А выбор сортов ячменя для данного опыта, а не другой злаковой культуры объясняется тем, что в КИЗ-е (сейчас КАЗ TOO КазАгроИнновации») проведена большая работа по отбору стандартных сортов ячменя по признаку устойчивости к высокой температуре. В связи с вышеуказанным, явилось интересным изучить активность обеих ферментов катаболизма глютамата у сортов ячменя, резко различающихся по устойчивости к высокой температуре. Поэтому нами были изучены и отобраны три резко контрастных сорта по устойчивости к высокой температуре.

Устойчивость проростков выбранных сортов ячменя к высокой температуре испытывали по методике описанной в руководстве под редакцией Г.В. Удовенко. Для опыта семена ячменя проращивали в течение 10 дней на чашках Петри на смоченной фильтровальной бумаге. Для осуществления стресса чашки Петри помещали в стерильный термостат при температуре 56⁰С в течение 2 часов. Затем в течение 3 дней наблюдали выживаемость проростков. Полную устойчивость к этой температуре проявили два сорта ячменя “Унумли-арпа” и “Иран-4470”, тогда как 10 дневные проростки сорта “Сауле” сильно пострадали от стресса.

Так как ФК осуществляет катаболизм глютамата без выделения токсического аммиака, то естественно, что мы предположили, что чем выше активность этого фермента, тем более высокой устойчивостью к высокой температуре должен обладать данный генотип. С целью проверки данного предположения нами было изучена активность ФК у вышеуказанных резко контрастных сортов ячменя. Одновременно изучалась активность ГДГ – фермента осуществляющего катаболизм глютамата с выделением токсического аммиака. Данные по изучению активности ФК и ГДГ у устойчивых к высокой температуре сортов ячменя – “Унумли-арпа” и “Иран-4470” и не устойчивого к высокой температуре сорта – “Сауле” представлены в таблице 11.
Таблица 11 – Активность ФК и ГДГ у устойчивых и не устойчивых к высокой температуре сортов ячменя

Из таблицы 11 видно, что активность ФК устойчивых к температурному стрессу сортов более чем в 2 раза превышает активность ФК чувствительного к высокой температуре сорта.

Эти данные однозначно говорят о том, что активность ФК может служить маркерным признаком генотипа ячменя с высокой устойчивостью к повышенной температуре. Следует указать, что активность ГДГ в несколько десятка раз меньше чем активность ФК, и её активность не коррелирует с признаком термоустойчивости генотипов ячменя.