Изучение структурных компонентов и физико-химических свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей как источника антиоксидантных лекарственных средств 14. 04. 02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

Про- и антиоксидантные свойства гуминовых веществ пелоидов условиях in vivo. Эксперимент выполнен на беспородных крысах самцах половозрелого возраста. При проведении опытов неуклонно соблюдали положения Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным [Касаткина Т.Б., 2000]. Животные содержались на стандартном лабораторном рационе в условиях свободного доступа к пище и воде. Экспериментальные исследования проведены в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г «Об утверждении правил лабораторной практики», Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005г.).

Данная группа животных составила группу сравнения. Полихлорированные бифенилы значительно активизируют процессы свободнорадикального окисления (СРО). Все показатели СРО достоверно изменялись по сравнению с контрольной группой (рис.4): светосумма, отражающая скорость расходования свободных радикалов за счет их взаимодействия с антиоксидантами, увеличилась на 60%; амплитуда быстрой вспышки, характеризующая содержание гидроперекисей, увеличилась на 11%; латентный период времени, определяющий скорость окисление липидов понизился на 33%.

Введение растворов компонентов гуминовых веществ сопровождалось статистически значимыми изменениями изучаемых параметров. В сравнении с животными, подвергшимися интоксикации «Соволом», у них наблюдалось снижение спонтанной светимости на 30,31% под действием гиматомелановых и на 52,38% –фульвовых кислот.


а)

б)




Рис 4. Значения параметров хемилюминесценции плазмы крови

на а) 3 сутки и б) 10 сутки исследования

Латентный период увеличился при введении крысам гиматомелановых и гуминовых кислот на 74% и 83% соответственно. Спонтанная светимость снизилась в 2-3 раза под действием гиматомелановых и гуминовых кислот пелоидов. Значения светосуммы также имели тенденцию к понижению.

Таким образом, наибольшей способностью угнетать свободнорадикальное окисление модельной системы, а значит, более высокой антиоксидантной активностью обладают гуминовые и гиматомелановые кислоты.

Данные Fe²⁺– индуцированной хемилюминесценции подтверждали результатами определения ТБК-реагирующих продуктов.

Максимальная концентрация продуктов тиобарбитуровой кислоты на третьи сутки в группе сравнения указывает на интенсификацию процессов свободнорадикального окисления липидов, которое несколько снижается (на 10 сутки) вследствии включения антиоксидантных защитных систем организма (рис. 5). Применение компонентов гуминовых веществ вызывает понижение уровня ТБК-реагирующих продуктов по отношению к группе сравнения на 24% при использовании фульвовых, на 63,7% - гиматомелановых, на 43,0% - гуминовых и 46,8% - гумусовых кислот пелоидов.

Влияние гуминовых веществ пелоидов на ферментативное звено антиоксидантных систем исследовали по активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и глутатионперокидазы (ГПО) до и после интоксикации бифенилами (табл.7).

Таблица 7

Влияние гуминовых веществ на активность окислительно-

восстановительных ферментов в модели окислительного стресса

Группа животных	СОД, Ед/мл	Каталаза, Ед/мл	ГПО, Ед/мл
Контроль	57,01±0,2	2,13±0,02	787±18,9
Сравнение	38,4±0,28	1,38±0,02	466±21,6
ГМК	58,61±0,20	2,13±0,09	709±24,92
ГК	55,73±1,61	2,00±0,02	630±23,83
ГсК	58,87±0,75	2,30±0,02	818 ±30,83
ФК	58,72±0,77	2,13±0,05	709±24,92

Введение «Совола» достоверно снижает активность всех антиоксидантных ферментов. При лечении экспериментальных животных растворами гуминовых веществ пелоидов уже к 3-им суткам наблюдалось повышение активности глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы, которая достигало нормативных значений.

Таким образом, определение количественных характеристик хемилюминесценции, ТБК-реагирующих продуктов и показателей основных антиоксидантных ферментов плазмы крови подтвердило, что свободнорадикальное окисление поддается коррекции при введении гуминовых веществ пелоидов.

Объективным критерием оценки антиоксидантной активности являются гистологические исследования. Гистологическая картина свидетельствует о том, что при моделировании окислительного стресса у крыс в печени развиваются выраженные патологические изменения, такие как гибель эпителиоцитов, нарушение радиального расположения печеночных балок и разрыв анастомозов между ними, изменение формы и размеров гепатоцитов. Часть гепатоцитов лишена ядер или находится в состоянии гидропической и баллонной дистрофии и характеризуется отсутствием гликогена в гепатоцитах печеночных долек. На десятые сутки в центральных зонах печеночных долек формируются очаги некроза с усилением венозного застоя (рис.6).

Рис. 6. Микрофото ткани печени крысы при интоксикации «Соволом». 10 сутки наблюдения. ШИК-реакция по Мак-Манусу. Ув. 400

Рис. 7. Микрофото гомогената печени крыс на фоне интоксикации «Соволом» и лечении ГМК, 3 сутки наблюдения. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.

Рис. 8. Действие ГМК на фоне интоксикации, 10 сутки наблюдения. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.

Под влиянием фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот на 3 сутки происходит уменьшение патологических изменений: синусоиды гемокапилляров умеренно расширены, причем степень расширения уменьшается от центра к периферии, в стенках сосудов и желчных протоков дистрофические изменения носят очаговый характер, большинство гепатоцитов имеют нормальную форму, размеры и структуру (рис.7). На 10 сутки в клетках обнаруживается гликоген, очаги некроза отсутствуют, структура стенки междольковых артерий и желчных протоков в триадах практически не отличается от структуры ткани печени крыс контрольной группы (рис. 8). Таким образом, для коррекции метаболических нарушений при острой интоксикации использованы антиоксидантные препараты группы гуминовых веществ.

ВЫВОДЫ:

1. 
   Установлена и экспериментально подтверждена зависимость антиоксидантных свойств в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей от характера сопряжения и особенностей структурной организации макромолекул.
   
2. 
   Специфические органические вещества, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, на основании совокупности результатов элементного, фотометрического и спектрального анализа относятся к группе гуминовых веществ и образуют генетический ряд: фульвовых, гиматомелановых и гуминовых кислот, характеризующихся общими и специфическими свойствами.
   
3. 
   Установлен структурно-групповой состав фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов методами ИК–, ЯМР– , ЭПР– спектроскопии. Гиматомелановые кислоты отличаются от других фракций присутствием карбонильных атомов углерода хиноидной, сложноэфирной, еноловой и кетонной природы. Детализирована природа парамагнитных центров, свидетельствующая о высокой реакционной способности гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей.
   
4. 
   Получены количественные характеристики окислительно-восстановительной активности в ряду гуминовых веществ пелоидов в условиях in vitro манометрическим, амперометрическим и хемилюминесцентным методами. Все фракции гуминовых веществ обладают антиоксидантной активностью, которая возрастает в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые, гиматомелановые кислоты и зависит от особенностей структурной организации соединений, определяющим фактором которой является характер сопряжения. Высокая антиоксидантная активность (in vitro) гиматомелановых кислот обусловлена сопряжением хиноидно – енолового типа с включением сложноэфирных фрагментов. Обнаружена полимодальная зависимость антиоксидантной активности гуминовых и гумусовых кислот.
   
5. 
   Разработаны методики амперометрического количественного определения отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей. Относительная ошибка методик определения не превышает для фульвовых кислот – 3,4 %, гиматомелановых кислот – 2,7%, гуминовых – 4,5% и гумусовых кислот –3,6 % . Валидационная оценка количественного амперометрического определения гуминовых веществ показала, что методики линейны, воспроизводимы и правильны.
   
6. 
   Доказана способность отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов диализировать через биологическую мембрану, возрастающая в ряду: гуминовые-гумусовые-гиматомелановые-фульвовые кислоты. Биодоступность возрастает в присутствии трансагентов и ионов металлов и с повышением рН раствора.
   
7. 
   По результатам гематологических и гистологических исследований выявлена способность гуминовых веществ пелоидов нивелировать воздействие свободно-радикального окисления при моделировании окислительного стресса in vivo, приводя показатели антиоксидантной защиты организма к норме. Установлено возрастание антиоксидантной активности в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые, гиматомелановые кислоты.
   

1. 
   Аввакумова Н.П. Роль гумусовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в ликвидации антропогенного загрязнения / Н.П. Авакумова, М.А. Кривопалова, А.В. Жданова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Специальный выпуск «XIIконгресс «Экология и здоровье человека», т1, 2007. С. 108-111.
   
2. 
   Катунина Е.Е. Динамика морфологических изменений в иммунокомпетентных органах крыс с адьювантным артритом в присутствии ГМК / Е.Е. Катунина, Н.П. Аввакумова, В.В. Россинская, А.В. Жданова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Специальный выпуск «XIII конгресс «Экология и здоровье человека», т2, 2008 С. 233-238.
   
3. 
   Аввакумова Н.П. Амфифильность гумусовых кислот как фактор гомеостаза лечебных грязей / Н.П. Аввакумова, Е.Е Катунина, М.А. Кривопалова, М.Н. Глубокова, А.В. Жданова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Тематический выпуск. Том 11 (27) №1 (6), 2009, С.1253-1255.
   
4. 
   Аввакумова Н.П. Оптимизация диализа гуминовых кислот (статья) / Н.П. Аввакумова, М.Н. Глубокова, Е.Е. Катунина, М.А. Кривопалова, А.В. Жданова, В.Я. Кириллова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Тематический выпуск. Том 11 (27) №1 (6), 2009, С. 1256-1258.
   
5. 
   Аввакумова Н.П. Некоторые особенности функционально-группового состава гумусовых кислот пелоидов/ Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, И.В. Фомин, А.В. Жданова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. № 11, 2010 С.24-27.
   
6. 
   Аввакумова Н.П. Антиоксидантные свойства гуминовых веществ пелоидов / Н.П. Аввакумова, А.Я. Герчиков, В.Р.Хайруллина, А.В. Жданова// Химико-фармацевтический журнал, т.45, №3, 2011 С. 50-51.
   
7. 
   Кривопалова М.А. Проницаемость в ряду гумусовых кислот пелоидов / Н.П. Аввакумова, М.Н. Глубокова, А.В. Жданова // Труды IV Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» – Санкт-Петербург, 2007. С. 105-109.
   
8. 
   Глубокова М.Н. Стандартизация биологически активной субстанции «гуминовые кислоты пелоидов» методом спектрофотометрии / М.Н.Глубокова, А.В.Жданова, Е.Е. Катунина // Сборник трудов II международной научной конференции молодых ученых-медиков. В 3-х томах.- Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2008.-Т.III–с.275-277.
   
9. 
   Аввакумова Н.П. Анализ термодинамических характеристик и биоэнергетических потенциалов в ряду гумусовых кислот иловых сульфидных грязей / Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, М.Н. Глубокова, А.В. Жданова // Биология: теория, практика, эксперимент: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 100 летию со дня рождения Е.В. Сапожниковой  – Саранск, 2008. – Кн. 1. – С. 137-140. 
   
10. 
    Avvakumova N.P. Structural components and biological activity among humic substances of low-mineralized silt sulphide muds.// N.P. Avvakumova, A.V. Zhdanova // International humic substances society “From molecular understanding to innovative applications of humic substances”–Moscow- St.Peterburg, 2008, Р 100-104.
    
11. 
    Аввакумова Н.П. Биодоступность компонентов лечебных грязей курорта «Сергиевские минеральные воды» / Н.П. Аввакумова, М.Н. Глубокова, А.В. Жданова // Научно-практическая конференция по восстановительной медицине, курортологии физиотерапии, посвященной 175-летию санатория «Сергиевские минеральные воды» – Серноводск, 2008. – С. 17-16.
    
12. 
    Аввакумова Н.П. Биологическая активность гумусовых кислот в сверхмалых дозах / Н.П. Аввакумова, М.А.Кривопалова, М.Н. Глубокова, А.В. Жданова //Механизмы действия сверхмалых доз: тез. докл. 4 Междунар. симпоз. – М., 2008. – С. 3-4.
    
13. 
    Аввакумова Н.П., Про- и антиоксидантные свойства гуминовых кислот пелоидов / Н.П. Аввакумова, М.Н. Глубокова, А.В. Жданова // XVI Международная научно-практическая конференция «Экология и жизнь» апрель 2009, Пенза – стр. 6-8.
    
14. 
    Аввакумова Н.П. Исследование адсорбционных свойств гиматомелановых кислот пелоидов // Н.П. Аввакумова, М.А Кривопалова, А.В. Жданова // VII Всероссийская конференция с Молодежной научной школой «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009», 1-5 июля 2009г, Уфа, стр 97-100.
    
15. 
    Аввакумова Н.П. Манометрическое определение антиоксидантных свойств гиматомелановых кислот пелоидов / Н.П. Аввакумова, А.Я. Герчиков, В.Р. Хайруллина, А.В. Жданова, М.А. Кривопалова, М.Н. Глубокова // VII Всероссийская конференция с Молодежной научной школой «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009», 1-5 июля 2009г, Уфа, стр.101-103.
    
16. 
    Жданова А.В. Инновационные подходы к использованию лечебных грязей Самарской области // Всероссийская конференция «Аспирантские чтения, 2009», Умник, коммерциализация результатов научно-технической деятельности» Самара, 2009, С. 32-33.
    
17. 
    Жданова А.В. Степень окисленности и антиоксидантные свойства в ряду гумусовых кислот //«Аспирантские чтения, 2009», труды региональной конференции «Молодые ученые - медицине», Самара, 2009 С. 199-202.
    
18. 
    Аввакумова Н.П. Антиоксидантные свойства гумусовых кислот в условиях in vitro и in vivo // Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А, Глубокова М.Н., Жданова А.В. // Труды V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» – Санкт-Петербург, 2010г, стр 132-135.
    
19. 
    Кривопалова М.А. Адсорбционные равновесия в системе гуминовые кислоты –Ag⁺ / М.А. Кривопалова, Н.П. Аввакумова, С.Х. Шарипова, А.В. Жданова // Труды V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» – Санкт-Петербург, 1-4 марта 2010г, С. 256-260.
    
20. 
    Аввакумова Н.П. «Оценка металлосвязывающей способности гумусовых кислот» / Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, А.В. Жданова // «Экология и жизнь»: сборник статей XVIII Международной научно-практической конференции. – Пенза: Приволжский Дом знаний, 2010, стр 5-7.
    
21. 
    Аввакумова Н.П. Исследование антиоксидантной активности гуминовых кислот пелоидов амперометрическим и хемилюминесцентным методом / Н.П. Аввакумова, А.В. Жданова, М.А. Кривопалова // Материалы международной конференции по аналитической химии и экологии, Казахстан, 2010 С. 215-216.
    
22. 
    Жданова А.В. Характеристика антиоксидантной активности гиматомелановых кислот пелоидов / А.В. Жданова, Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, М.Н. Глубокова// VII Международной конференции «Биоантиоксидант», тезисы докладов, г. Москва, 2010 – С. 155-157.
    
23. 
    Удостоверение на рационализаторское предложение № 122 ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» от 1 февраля 2011г. «Средство природного происхождения для лечения инфицированных ран на основе хелатокомплекса гуминовых кислот пелоидов с ионами серебра» / А.В. Жданова, Н.П. Аввакумова, Ю.В. Жернов.
    

Формат 60х84. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Бумага офсетная. Печать оперативная. Заказ___.

Отпечатано в типографии ООО «Офорт».