Катлинский, Сазыкин. Курс лекций по биотехнологии
жүктеу/скачать 2.51 Mb. Pdf көрінісі
|
| Лекция 7.
БИОТЕХНОЛОГИЯ АМИНОКИСЛОТ План 1. Методы получения аминокислот 2. Механизмы регуляции биосинтеза аминокислот 2.1.Биосинтез лизина 2.2.Биосинтез треонина 3. Особенности культивирования штаммов-продуцентов 3.1.Особенности питательной среды 3.2.Условия ферментации аминокислот 3.3.Применение генной инженерии 4. Контроль качества аминокислот 4.1. Хроматографирование (тонкослойная хроматография ТСХ в анализе аминокислот) Методы получения аминокислот Аминокислоты являются составными элементами белков. Все 20 аминокислот являются мономерами для построения природных полипептидов и хорошо изучены (методы их синтеза давно подробно описаны). Известно также, что эти соединения существуют в виде оптических изомеров (вспомните теорию строения органических соединений Бутлерова А.М., открывшего ассиметрию атома углерода с четырьмя заместителями, определяющими направление и степень вращения плоскости поляризованного света) . Современные методы органического синтеза позволяют синтезировать L- и D- формы аминокислот, но только как рацематы, дальнейшее разделение которых представляет трудную задачу и экономически не эффективно. Другой способ получения аминокислот – это микробиологический синтез, когда используют штаммы-продуценты, осуществляющие сверхсинтез аминокислот. Избыточные количества аминокислот, например, L -лизина, L -глутаминовой кислоты, L -треонина, L –трептофана экскретируются (выходят) в культуральную (внешнюю) среду. Культуральная среда в этом случае может содержать от четырех, пяти и до ста граммов целевой аминокислоты на один литр жидкой фазы. В отличие от химического синтеза, в этом случае, то есть при биосинтезе аминокислот с помощью ферментных систем микроорганизмов, получаются исключительно L-формы аминокислот, обуславливающих терапевтический эффект, а не рацематы. Это обстоятельство решает проблему 49 выбора получения аминокислот в промышленном масштабе в пользу биотехнологических методов. Аналогичная ситуация сложилась и в области производства антибиотиков. Химический синтез, как правило, не эффективен. Именно поэтому в фармацевтической промышленности антибиотики получают с помощью штаммов-продуцентов, которые генерируют нужный антибиотик в определенной фазе роста в заданном режиме культивирования. Однако, использование в дальнейшем химической трансформации природных антибиотиков рождает новые лекарственные средства и помогает преодолевать резистентность микроорганизмов к лекарственным препаратам, повышая эффективность лечения. Сегодня известны 4 метода получения аминокислот: 1. химический метод (тонкий органический синтез) 2. химико-энзиматический метод (энзиматическая трансформация химически синтезированных предшественников аминокислот с образованием биологически активных L-изомеров). Метод достаточно дорогой. 3. биологический метод ( применение гидролиза белоксодержащих субстратов) 4. прямой микробиологический метод (получение L-аминокислот). Метод более дешевый, экономически выгодный. Наиболее распространенными методами получения аминокислот являются химико-энзиматический и микробиологический. В качестве примеров использования химико-энзиматического метода можно привести: • синтез аспарагиновой кислоты из фумаровой (используются клетки Escherichia coli) • синтез L-фенилаланина из коричной кислоты (используются клетки дрожжей). Имея задачу получения аминокислот, используя природные микроорганизмы, надо помнить о механизмах регуляции биосинтеза по принципу обратной связи (ретроингибирование). Эта регуляция осуществляется либо за счет ингибирования активности одного из начальных ферментов собственного синтеза избыточным продуктом, то есть самой аминокислотой, либо репрессируется весь комплекс ферментов всей биохимической цепочки метаболизма клетки, что является естественной реакцией живого микроорганизма-продуцента для сохранения собственного равновесия на клеточном уровне. Таким образом перед биотехнологом стоит задача в 50 нарушении этих механизмов, чтобы иметь возможность получить целевой продукт в необходимых количествах. Как это делается, можно рассмотреть на примере продуцентов лизина (Corynebacterium glutaminicum) и треонина (Escherichia coli). У Corynebacterium glutaminicum есть принцип согласованного ингибирования ферментативной активности, что является особенностью биосинтеза биосинтеза предшественника лизина. Ингибирование синтеза лизина в клетке возможно только при повышенной концентрации обеих конечных продуктов – лизина и треонина. Самостоятельно ни лизин, ни треонин не ингибируют активности ключевого фермента –аспартакиназы. Они ингибируют этот синтез только вместе. Таким образом, вызвать сверхсинтез лизина можно лишь нарушив синтез треонина или его предшественника – гомосерина. Действительно, большинство продуцентов лизина не способны синтезировать гомосерин или треонин, то есть являются «ауксотрофами» по этим аминокислотам. Таким образом большинство продуцентов лизина нуждается в присутствии гомосерина или треонина, иначе они работать не будут. Зная это, биотехнолог, выращивая такие продуценты, должен обязательно вносить в питательную среду от половины грамма и до полутора граммов на один литр гомосерина или треонина. В этом случае происходит активный рост биомассы продуцента без синтеза лизина. Как только треонин исчезает из среды и рост биомассы прекращается, начинается активный синтез лизина. Таким образом, данный процесс имеет две стадии развития 1. рост биомассы 2. синтез лизина Продолжительность синтеза составляет 2-3 суток. Уровень накопления продукта составляет 50-100 граммов на литр. Это особенности биосинтеза лизина. Второй пример. Минтез треонина. Особенности регуляции биосинтеза треонина в клетках Escherichia coli (кишечной палочки). В этом случае ситуация другая. У кишечной палочки нет механизма согласованного ингибирования ферментативной активности, то есть, если лизин ингибирует активность своих ферментов по принципу обратной связи, то треонин – своих ферментов. Кроме того, имеет место «репрессия» всего комплекса треониновых ферментов при избытке треонина или изолейцина и это похоже на «согласованную репрессию» Самостоятельно (по отдельности) ни треонин, ни изолейцин не репрессируют синтез ферментов. 51 Для решения задачи получения треонина в необходимых количествах пришлось сделать следующее: 1. изменить, сделать нечувствительным к треонину первый фермент треонина 2. снизить активность фермента, синтезирующего из треонина изолейцин 3. убрать механизм репрессии при недостаточном количестве изолейцина несмотря на избыток треонина 4. применить генную инженерию (выделить треониновые гены и размножить их на плазмидах в клетке микроорганизма, резко повысив синтез треонина клетками продуцента) В рассматриваемом случае синтез треонина отличается от синтеза лизина тем, что его синтез происходит одновременно с ростом биомассы. Здесь уже нет двух стадий. Особенности культивирования штаммов-продуцентов аминокислот приводят к следующему результату: 1. достигаются максимально высокие скорости синтеза аминокислот клетками продуцента 2. достигается максимальная длительность работы продуцента 3. минимально образуются побочные продукты биосинтеза аминокислот. Первая задача решается путем выращивания высокоактивной биомассы и помогают в этом случае наличие в питательной среде: источников углерода, аммонийного азота, минеральных солей, ростовых факторов; оптимизация рН (кислотность среды) температуры; дробная подача субстратов. Для предотвращения закисления среды проводят автоматическое рН- статирвоание аммиачной водой и источниками углерода. В случае биосинтеза лизина добавляют ростовые факторы по мере необходимости, что зависит от самого сырья, от аппаратуры, от температуры. Процесс биосинтеза энергоемкий и требует интенсивной аэрации и перемешивания. Для длительной работы ауксотрофных продуцентов лизина в питательную среду вносят комплексный источник аминокислот (белковые гидролизаты). 52 Внимание! Синтез нужной аминокислоты может прекращаться, если на ее продуцент действуют его токсические метаболиты, которые синтезируются самим продуцентом. Например, в процессе биосинтеза фенилаланина, продуцентом которого является Bacillus subtilis, этот продуцент синтезирует примеси ацетоина и бутандиола, в результате этого клетки продуцента лизируются, образуют споры и прекращают вырабатывать фенилаланин. Чтобы избежать это явление, необходимо ферментацию вести в условиях лимита (ограничения) по источнику углерода. В этом случае весь сахар расходуется только на синтез фенилаланина, увеличивая как количество (в два раза), так и чистоту получаемого продукта. В заключение можно сказать, что: - эффективность использования субстрата при биосинтезе аминокислот зависит от продуктивности биомассы, - если синтез аминокислот разобщен с ростом биомассы ( смотри лизин), то эффективность использования субстрата будет тем выше, чем дольше будет работать культура после остановки роста, - если же синтез аминокислоты идет параллельно росту биомассы (смотри треонин), то эффективность биомассы можно увеличить добавляя определенное количество предшественников. Наиболее перспективным направлением являются методы генетической инженерии – введение в клетку продуцента многокопийных плазмид, содержащих гены, контролирующие биосинтез аминокислот в ущерб синтезу биомассы и других клеточных компонентов. С помощью гибридных плазмид в биосинтезе аминокислот мы получаем 1. рост продуктивности биомассы 2. исчезновение примесей (более чистый продукт) 3. возрастает коэффициент использования субстрата (его минимум дает максимум продукта). жүктеу/скачать 2.51 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|