Применение  иммобилизованных  ферментов  и  белков  в  медицине

 
60
   Интересные  возможности  были  обнаружены  при  использовании  ферментов 
для  повышения  чувствительности  иммунохимических  методов  анализа.  Суть 
любого  иммунохимического  анализа  в  том,  что  после  завершения  реакции 
антиген-антитело  определить  концентрацию  избыточного  компонента 
(антигена  или  антитела),  не  вступившего  в  реакцию.  Поскольку  эти 
концентрации  очень  невысоки (10 
-12
    -  10 
-8
    моль/л),  то  для  их  обнаружения 
обычно 
применяют 
легко 
детектируемую 
(определяемую) 
метку 
радиоактивным    атомом,  вводимым  в  один  из  компонентов  (радиоактивный 
иод,  тритий).  Оказалось,  что  можно,  без  потери  чувствительности  метода, 
заменить  радиоактивную  метку  на  присоединение  фермента,  который  можно 
обнаружить  по  его  каталитической  активности.  Таким  образом,  с  помощью 
иммуноферментного  анализа  (ИФА)  могут  быть  определены  любые  вещества, 
обладающие  свойствами  антигенов  и,  конечно,  многочисленные  возбудители 
заболеваний человека, животных, растений. 
    Переходим  к  проблеме  некоторых  промышленных  процессов  с 
использованием  иммобилизованных  ферментов  и  клеток.  Прежде  всего,  нас 
интересует получение  
L-аминокислот. 
    Как  известно,  аминокислоты – главный  строительный  материал  организма, 
который  формирует  пептиды  и  белки.  В  отличие  от  растений  и 
микроорганизмов,  которые  способны  синтезировать  все  нужные  им 
аминокислоты  из  более  простых  химических  соединений,  человек  способен 
синтезировать  лишь 12 из 20 аминокислот,  необходимых  для  его 
жизнедеятельности.  Остальные 8 аминокислот –(валин,  лейцин,  изолейцин, 
треонин,  метионин,  лизин,  фенилаланин,  триптофан)-  получили  название 
незаменимых и должны поступать в организм с пищей. При нехватке хотя бы 
одной из незаменимых аминокислот замедляется  рост организма, проявляется 
патология.  В  этой  ситуации  важно  уметь  синтезировать  эти  аминокислоты  в 
промышленных  масштабах  для  корректировки  питания  в  лечебных  и 
профилактических целях. 
   Здесь важно отметить, что производство многих аминокислот, в том числе и 
незаменимых, - составляет большую  отрасль химической промышленности. Но 
с  помощью  химических  методов  получается  смесь  оптических  изомеров 
аминокислот  (это  смесь L-  и D-аминокислот).  В  химических  реакциях  эти 
изомеры  почти  не  различимы,  но  человеческий  организм  усваивает  только L-
аминокислоты 
(за 
исключением 
метионина). 
Для 
большинства 

 
61
биотехнологических  процессов D-аминокислоты  также  не  представляют 
ценности. 
    Разделение  смеси L-  и D-аминокислот  на  составляющие  их  изомеры  стало 
первым  процессом  в  мире,  осуществленным  с  помощью  иммобилизованных 
ферментов на промышленном уровне.  
   Механизм разделения заключается в том, что используя в качестве исходного 
вещества  ацилированные    L-    и D-аминокислоты,  полученные  органическим 
синтезом,  прибегают  к  помощи  фермента  аминоацилазы,  которая  гидролизует 
один  ацил –L-изомер,  отщепляя  от  него  ацильную  группу  и  резко  увеличивая 
растворимость  образующейся L-аминокислоты  в  отличие  от  ацил-D-изомера. 
После этого вещества легко  отделяются друг от друга и получается чистая L-
аминокислота. Остающаяся ацил- D-аминокислота переходит в исходную смесь 
ацилированных  L-  и D-аминокислот, и процесс повторяют снова. Оказалось, 
что  для  аминоацилазы  не  имеет  значения,  какую  аминокислоту  ей 
гидролизовать,  важно  только  строение  ацильной  части,  к  которой  фермент 
имеет  строгую  специфичность.  Поэтому  одна  и  таже  реакционная  колонна  с 
иммобилизованной  аминоацилазой  может  быть  применена  в  производстве 
самых различных аминокислот. 
   В  промышленном  процессе  производства  аминокислот  очень  важно.  Что 
иммобилизованный фермент легко готовить, так как он легко адсорбируется на 
специальной  смоле,  которую  затем  помещают  в  реакционную  колонну.  Когда 
активность  катализатора  падает  ниже  нормы,  в  колонну  добавляют  раствор 
свежего фермента (раз в несколько месяцев). Полимерный носитель отличается 
устойчивостью и может быть использован в течении нескольких лет. 
  Другая задача. Получение 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) 
  Бензилпенициллин  является  исходным  сырьем  для  получения (6-АПК),  но  в 
его  молекуле  присутствует  чрезвычайно  лабильное  беталактамное  кольцо  и 
проведение  химического  деацилирования  бензилпенициллина  представляет 
трудную  задачу.  Поэтому  в  промышленности  использовали  для  обработки 
бензилпенициллина  бактериальную  массу E. coli, которая  содержит  фермент 
пенициллинамидазу.  Этот  фермент  расщеплял  именно  ту  амидную  связь, 
которая  необходима  для  образования 6-АПК.  В  результате  применения 
иммобилизованных бактериальных клеток, содержащих пенициллинамидазу, а 
затем  и  самой  иммобилизованной  пенициллинамидазы,  удалось  значительно 
повысить продуктивность и экономичность промышленного получения 6-АПК. 
  Одним  из  интересных  примеров  применения  биокатализа  является  его 
использование  в  тонком  органическом  синтезе.  Уникальная  специфичность 

 
62
действия ферментов, возможность проведения процессов в «мягких» условиях, 
протекание реакций с высокой скоростью при использовании малых количеств 
катализатора,  практическое  отсутствие  побочных  реакций – все  это  делает 
биокаталитические процессы перспективными с технологической точки зрения. 
Эти  преимущества    широко  используются  при  создании  лекарственных 
препаратов (антибиотики, стероиды, простагландины и так далее). 
   Для осуществления биокаталитического процесса необходимо: 
1.  провести 
поиск 
фермента 
необходимой 
специфичности 
или 
стереоспецифичности 
2.  изучить основные свойства исходных веществ и продуктов реакций 
3.  выявить  факторы,  определяющие  эффективность  биокаталитического 
превращения 
4.  создать 
на 
основе 
фермента 
подходящий 
катализатор 
для 
технологического процесса 
5.  провести аппаратурное оформление биотехнологического процесса. 
  Наибольшее применение в практике пока нашли гидролитические ферменты по 
причинам: 
1.  гидролитические  реакции  термодинамически  полностью  сдвинуты  в 
сторону образования продуктов 
2.  кинетика  реакций  ферментативного  гидролиза  легко  описывается  в  
количественном выражении 
3.  гидролазы наиболее изучены и легко управляемы 
4.  проведение  оптимизации  гидролитических  ферментативных  реакций  в 
водном  растворе  проходит  по  двум  параметрам – концентрации 
расщепляемого субстрата и активности фермента. 
Особенно  эффектно  возможности  и  достоинства  гидролаз  были 
продемонстрированы  при  модификации  самых  эффективных  и  широко 
применяемых  антибиотиков – пенициллинов  и  цефалоспоринов.  Получение 
новых,  более  эффективных  аналогов  пенициллина  связано  с  изменением  его 
боковой  цепи  при  сохранении  целостности  остальной  части, «ядра» 
антибиотика -6-АПК 
Поскольку  масштабный  химический  синтез  таких  соединений  невозможен, 
самым  простым  путем  проведения  необходимого  превращения  является 
отщепление боковой цепи биосинтетического пенициллина, выделение 6-АПК 
и 
последующее 
ацилирование 
ее 
аминогруппы 
с 
получением 
«полусинтетического»  аналога.  Такая  модификация  представляет  сложную 
задачу,  так  как  при  удалении  боковой  цепи  необходимо  расщепить  весьма 

 
63
устойчивую амидную связь и сохранить значительно более лабильную связь в 
беталактамном  кольце  пенициллина;  ее  разрушение  ведет  к  необратимой 
инактивации  антибиотика.  Провести  такую  химическую  реакцию  в  обычных 
условиях не удается, так как при щелочном гидролизе пенициллинов выход 6-
АПК не превышает 1%. Поэтому для  удаления  бокового радикала  в молекуле 
антибиотика  химическим  путем  необходим  специальный  подход,  например, 
получение  его  иминоэфира  и  последующий  гидролиз  иминоэфира  при  низкой 
температуре. 
Это 
процесс 
мгогостадийный, 
энергоемкий, 
требует 
использование больших  объемов органических  растворителей. 
   С  другой  стороны,  подобное  избирательное  превращение  может  быть 
проведено  в  одну  стадию  в  самых  обычных  условиях  в  водной  среде  с 
использованием фермента пенициллинамидазы. 
   Таким  образом  переход  к  биокаталитической  технологии  значительно 
упрощает  процесс,  позволяет  поднять  выход  целевого  продукта,  увеличить 
объем  производства.  аконец,  внедрение  масштабного  производства 6-АПК 
привело  к  существенному  увеличению  выпуска  полусинтетических 
пенициллинов и снижению их себестоимости. 
   Аналогичным  образом  иммобилизованная  пенициллинамидаза  используется 
при  получении 7-аминодезацетоксицефалоспориновой  кислоты,  которая 
является ключевым соединением для синтеза новых цефалоспоринов. 
 
В заключение рассмотрим схему получения иммобилизованной аминоацилазы. 
   Продуцент  фермента – бактерии  Е.соli.  Эту  микробную  культуру 
выращивают  и  получают  культуральную  жидкость.  Культуральная  жидкость 
является источником фермента. 

 
64
Схема получения иммобилизованной аминоацилазы. 
                       
                           Нативный раствор культуральной жидкости 

жүктеу/скачать 2.51 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: