ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Источником специфических иммуноглобулинов служили сыворотки больных РА с заранее определенными высокими титрами антител к СОД (экстинкция > 0,14 Ед), ГР, ЦП, КАТ, АДА (экстинкция > 0,17 Ед), 5'-НТ, ПНФ, ГДА (экстинкция > 0,16 Ед), КО (экстинкция > 0,19 Ед). "Чистые" антитела к ферментам получали с помощью соответствующего антигенного иммуносорбента, с которым была проведена инкубация сывороток больных при 37°С на магнитной мешалке в течение 1 часа, а затем диссоциация комплекса антиген-антитело с помощью 0,1М глицин-HCl буфера (pH=2,5). После соответствующего диализа против ЗФР и последующего концентрирования через полупроницаемую мембрану системы "Sartorius" до первоначального объема сыворотки, антитела к СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО использовались в эксперименте по изучению их взаимодействия с соответствующим ферментом: была проведена инкубация антигенного иммуносорбента и растворимой формы фермента с полученными антителами в течение 1 часа при 37°С на магнитной мешалке. Затем определена ферментативная активность. В качестве контроля применяли растворы СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО в физиологическом растворе (n=30, для каждого фермента) и сыворотки практически здоровых людей (n=30).

Таблица 7.

Сравнительная характеристика активности растворимой и иммобилизированной форм

Совершенно другая картина наблюдалась при изучении влияния специфических иммуноглобулинов на активность КО. Так активность растворимой формы КО после взаимодействия со специфическими («чистыми») Ат увеличилась незначительно (р=0,151); различия с контрольной группой (физиологический раствор) и донорами статистически не достоверны (р=0,067 и р=0,071, соответственно). Увеличение активности иммобилизированной формы КО по сравнению с исходными значениями произошло в среднем на 25-30% (р=0,047); выявлены статистически достоверные различия с физиологическим раствором (р=0,044) и донорами (p=0,024) (см. таблицу 7).

Включение фермента в пространственную решетку полиакриламидного геля, составляющего основу ИГАП, (иммобилизированная форма) придает антигену (ферменту) новые свойства, благодаря которым он приобретает определенные преимущества перед растворимой формой. Такой метод приводит к возникновению незначительных конформационных изменений, сохраняющих активность фермента, но, в то же время, способствующих, например, экспрессии гидрофобных участков молекулы энзима, содержащих «скрытые эпитопы».

Параллельно в иммуноферментном методе были исследованы сыворотки крови больных РА (n=30 для каждой серии опытов) на наличие антител к СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО после взаимодействия со специфическим магнитоуправляемым сорбентом, в результате которого исходная концентрация антител к ГР, КАТ, ЦП, 5'-НТ и ПНФ уменьшилась в 2,5 − 2,8 раза, а уровень Ат к СОД, АДА, ГДА снизился почти в 3,2 – 4 раза (см. рисунок 4).

Рисунок 4. Содержание антител к 5'-НТ, ПНФ, ГДА в сыворотке крови больных РА после взаимодействия со специфическим магнитоуправляемым сорбентом.

ЦИК, осажденные из сывороток больных РА были ресуспензированы до 1 мг/мл. Выделенные ЦИК вызывали торможение реакции супероксидзависимого восстановления нитросинего тетразолия. Выявляемая СОД–активность ЦИК составила 32 ± 9,6 Ед/мл. Было проведено исследование СОД-активности ЦИК в плазме больных РА. При воздействии на плазму смесью этанола, хлороформа и KH₂PO₄ c целью осаждения компонентов крови, препятствующих определению СОД, было получено, что исходный уровень ЦИК уменьшился » в 2 раза. После осаждения ЦИК в супернатанте плазмы 7% ПЭГ концентрация белка составила 852±21,1 мкг/мл, а СОД–активность – 2,4±0,35 Ед/мл. Это активность циркулирующих иммунных комплексов, состав которых может быть различен у больных РЗ, в том числе и СОД–Ат. Сохранение значительной активности растворимой формы СОД можно связать с проявлением СОД–активности образовавшихся иммунных комплексов (СОДраст.–Ат).

Полученные результаты демонстрируют в основном ингибирующее влияние специфических иммуноглобулинов на ферментативную активность изучаемых энзимов. Тем не менее, антиферментные Ат, как правило, специфичны не по отношению к активному центру энзима, а по отношению к белку в целом. Если антигенные детерминанты фермента расположены вне его активного центра, то последний и в фермент-антиферментном комплексе может оставаться доступным для субстрата (например, 5'-НТ и ПНФ). В случае, когда участки фермента, от которых зависят его антигенные свойства, частично захватывают и область активного центра (например, КАТ и ГДА), антифермент может выступать в качестве ингибитора, конкурирующего с субстратом.