Табл.1. Ортологи NrpR в исследованных геномах

Табл.1. Ортологи NrpR в исследованных геномах.

Геном	Название гена	Количество доменов
Methanococcus maripaludis	nrpR	3
Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH	MTH1569	3
Methanocaldococcus jannaschii	MJ0159	3
Methanosarcina mazei	MMZ1085	2
Methanosarcina acetivorans	MA4404	2
Methanococcoides burtonii	MCB_070_0278	2
Methanopyrus kandleri	MK0337	2
Methanosarcina barkeri	nrpR	2
Archaeoglobus fulgidus	AF2227	2

Рис. 4. Филогенетическое дерево НТН-доменов белка NrpR. MTH-Methanobacterium thermoautotrophicum, MMZ-Methanosarcina mazei, MJ-Methanocaldococcus jannaschii, MA-Methanosarcina acetivorans, MK-Methanopyrus kandleri, MM-Methanococcus maripaludis,MCB-Methanococcoides burtonii, AF-Archaeoglobus fulgidus,MB-Methanosarcina barkeri.

По строению гомологов NrpR все исследованные организмы могут быть разделены на 3 группы. К первой относятся M.maripaludis, М.thermoautotrophicum deltaH и M.jannaschii, имеющие по одному полному ортологу, включающему все три домена. Ко второй группе относятся Archaeoglobus fulgidus и M.kandleri, в которых был найден один двухдоменный гомолог, состоящий из НТН-домена и одног потенциального олигомеризующего домена. Третья группа включает в себя M.mazei, M.acetivorans, M.burtonii, M.barkeri, в геномах которых есть два гомолога. Один из гомологов содержит ДНК-связывающий домен и один из предполагаемых олигомеризующих доменов, тогда как другой содержит лишь предполагаемых олигомеризующий домен (Рис.5a,b). Возможно, данный белок обеспечивает олигомеризацию NrpR или ответственен за взаимодействие с эффектором.

В M.maripaludis НТН-домен был картирован ранее биоинформатическими методами (Lie and Leigh, 2002, Aravind and Koonin, 1999). Ортологи NrpR хорошо вырывниваются, что позволяет достаточно точно, на основании предсказанной последовательности этого домена для Methanococcus maripaludis, определить границы НТН-домена в найденных ортологах NrpR. На рисунке 5b аминокислоты, принадлежащие НТН-домену, показаны белым на черном фоне. Из выравнивания NrpR белков видно, что для гена МА4404 в M.acetivorans был неправильно определен старт транскрипции (Рис. 5b).

Поиск ортологов регулируемых генов, как предполагаемых членов регулона

MTH1569 N C

MJ0159 N C

MM_NrpR
Methanopyrus kandleri

MA4404 N C

MA0822 N C

MMZ1085 N C

MMZ1969 N C

Methanosarcina barkeri

MB_NrpR N C

MCB_063_0041 N C

MCB_070_0278 N C

MA_MA4404 LRPVQNALICGLYGFITIIRKVHGIDTGYNGVIDMMDPQIERKLIEIMRVIHESDKPIGA

MMZ_MM1085 ----------------------------------MMDPQIERKLIEIMRVIHESDKPIGA

MB_NrpR ----------------------------------MMDPQIERKLIEIMRVIHESDKPIGA

MCB_063_0041 ----------------------------------MTDPQIERKLIEIMRVISESDKPIGA

MB_NrpR2 ------------------------------------------------------------

MMZ_MM1969 ------------------------------------------------------------

MA_MA0822 ------------------------------------------------------------

MCB_070_0278 ------------------------------------------------------------

MK_MK0337 ---------------------------------------MNRLDVMILKILAEADRPMGS

MMs_nrpR_ --------------------------------------MDSNIDVEILSILSEASAPVGA

MJ0159 ---------------------------------MIIMADLDRKLIEILDILSKSKEPVGA

MTH1569 -------------------------------MVFLMADETNQKMMEILRILAEHDDVLGA

AF_AF2227 -----------------------------------MAVNLLMVEEEILSVLEESG-ALSS

MA_MA4404 RAIADELNNR-GYDIGERAVRYHLRILDERGFTNKHGYAGR----TLTDLGESEMNDALI

MMZ_MM1085 RAIADELNNR-GYDIGERAVRYHLRILDERGFTRKHGYAGR----TLTDLGENEMNDALI

MB_NrpR RAIADELNNR-GYDIGERAVRYHLRILDERGFTSKHGYAGR----TLTELGEREMNDALI

MCB_063_0041 RNIADELQSR-GYNLGERAVRYHLRILDERGFTEKHGYNGR----TITTFGRKELDDALI

MB_NrpR2 ------------------------------------------------------------

MMZ_MM1969 -----------------------------------------------------MQK---N

MA_MA0822 -----------------------------------------------------MQK---N

MCB_070_0278 -----------------------------------------------------MIK---Q

MK_MK0337 GRIAELIEERFGEKYSTRSIRYRLQKMEERGLIRRVRRNDRVVGAEITEWGLTMLKTETS

MMs_nrpR_ KIIADSLKDR-GYDIGERAVRYHLKVLDENSLTKKLGYSGR----EITEKGIEELEKANI

MJ0159 KIIAKELNKR-GYKIGERAVRYHLKLLDGMKLTKKVGYAGR----VITERGLEELEKANI

MTH1569 KIIASELRKK-GYNLGERAVRYHMRILDEKGFTERVGYAGR----RITEKGLQEINRGLV

AF_AF2227 KEIELELRKR-GYNIRARTIRYHLKKLEERGLVRKNS-NGK---TELTEKGEKELKRKSA

MA_MA4404 GDRFGFVISRIEEMAFRTTYDPETDKGDVVVNISYFDKDDFETVVDLVSYTAHAGYMISP

MMZ_MM1085 GDRFGFVISRIEEMAFRTTYNPETDKGDVVVNISYFDKDDFETVIELISYTAHAGYMISP

MB_NrpR ADRFGFVISRIEEMAFRTTYNPKTNEGVVPVNISYFDKDDLETVIEVVSYTAHEGYMISP

MCB_063_0041 GDRLGFVITRIEELIYNTNYDPISKEGNVIVNLSTLDKNDFDNALDVMKYAASGGMCISP

MB_NrpR2 --------------MYRTTFDPKKMDGDIILNLSLIDKKDLDDVLGIFKMVISSGLSVTP

MMZ_MM1969 GYRIQFTSSRIRDLMYRTTFDPKKMDGDIILNLSLIDKKDLDDVLGIFKMVISSGLSVTP

MA_MA0822 GYRIQFTSSRIRDLMYMTTFNPKKMDGDVILNLSVIEKKDLDDVLGIFKMVISSGLSVTP

MCB_070_0278 PNRVQFTSSRIEDLMYRTTFDPVNMTGELIVNQSLVKEKDLEAVLEVYNLVIRSGLSVSP

MK_MK0337 SERVGMYISLIEEMAYRCSFDPEVMKGKVVCNISVVKREHLDDFLDAVVETYRAGISPSP

MMs_nrpR_ SFRIGSVFSQVIEKLYLSDFP-----SKVLINTAKFEGD-YKTIKEMVLRSFEAGYSVGD

MJ0159 SYRLGSIYSNILEKTISANYRF----GYVVINRCQVYAD-FNDVLKIIKSVYESGLAVGD

MTH1569 YDQVDFIFSKFESMIYNTSFNPDTLEGKVVVNTSRISP---RSI-ETLKHVMRNGLCLSP

AF_AF2227 FERLGEFSERIEYNVYLSNFDLYTLSGLVPTNFAFIDKSLFERAMEIVEECISQPISISN

: . : * . .
MA_MA4404 RVRIFEED-SESEIHLPPGKIGIATVCSVTFDGLLLKAGIPVEPAYGGILQIENKKPSRF

MMZ_MM1085 RVRIFEED-S-LEMSLPPGKIGIATVCSVTFDGLLLKAGIPVEPAYGGILQIENKKPARF

MB_NrpR RVRIIEED-E-ELLSLPPGKVGIATVCSVVFDGLLLKAGIPVEPAYGGIIQIENRKPARF

MCB_063_0041 NIKIFEED-SDSGVYVPEGSVGIATVCSITYDGVLLRNGIPVKPVYGGILEMEHNDPVQF

MB_NrpR2 YVKIVSEGESIGDLTVEKGKVGVGTVCSITIDGVLLKAGIPVNPKLGGVVQIRNGVPVRF

MMZ_MM1969 YVKVISEGESIGDMTIEKGKVGIGTVCSITIDGVLLKAGIPVNPKLGGVVQIRNGIPVRF

MA_MA0822 YVKVISEGESIGNLTVGKGKVGIGTVCSITIDGVLLKAGIPVHPKLGGVVQIRNGIPIRF

MCB_070_0278 FLKIIKSGETIGDLKIAQGDVGIATVCSITIDGVLLKGGVMINPRFGGVVQIKNGQPVRF

MK_MK0337 LV-AVKEDLSDHDVEVGEDEVAVLTVCSVTIDGVLINRGIPVTPVCGGLLYLEDGEPLGM

MMs_nrpR_ YLNIKKKG----------NTVSVETLCSITFDNFLLKNGIIPTPEYGGIVKFEDYEPVNF

MJ0159 RVGIIDRE----------KFVEINTLCSLNFDNILLQNGIFPLHVCAGVVKYEDGKPVEF

MTH1569 RVKLERDG----------DGCIISTICGTTVDGILLASGIPVIPQFGGLVRFEDHQPVNF

AF_AF2227 RIFIAEEGESLGGYTVPKNSFALGVISNTIYDVILKTAGVNTTPEYAGLMSVENMEARGL

: : .:.. * .* *: .*:: .. . :

MA_MA4404 LDLISYSGTSIDPIKIFMNRTPTSVLEVLEKGDGKILANMRQINASAYDTAKGIMKKAEK

MMZ_MM1085 LDLISYSGTSIDPIKIFMNRTPTSVLEVLEKGEGKILANMRQINSSAYEMTGKILKKAEK

MB_NrpR SDLISYSGTSIDPIQIFMSRKTTSVLDVLEKGEGKILANMRQINCSAYERAREVLKTVEK

MCB_063_0041 RDLISYSGTSIDPVKIFMIRHATSVLDVLDTGNGRILANIRTIPSSAVDKAQEVLHQLEA

MB_NrpR2 TDVLTYVSTTVDPLEILMSQGITSVSEMLRTGSGKVLANLREAPMVARDEIESCLSDLLD

MMZ_MM1969 TDVLTYVSTTVDPLEILMSQGITSVSEMLRTGSGKVLANLREAPMVARDEIESNLSDLLD

MA_MA0822 TDVLTYVSTTVDPLEVLMSQGITSVSEMLRTGSGKVLANLREAPMVARDAIESTLSDLLD

MCB_070_0278 TDVVTYASTTIDPLEVLMSQDITSVTKMLRTGSGKILANLREAPLVARDDIDHILSDLME

MK_MK0337 QEYIKYEGSTVDPLHVFVAKGMTQVERVLETGTGLVPANVRYVPWAALEDVEHVERELEK

MMs_nrpR_ EGVIDFKSSSIDPLVAFIMQGKTDVIGVIENGEGLVPANFRVIPKSSEKQFETILKKDM-

MJ0159 KEIIDYKSTSIDPLRAFIEKKETDVMGIIENGEGYLPANFRYFGVEFLERFETILEIDE-

MTH1569 TELIAYKKTSMTPLEAFTSENMTSVLSVIEEGDGLVPANLRLVPGTGREDAVKILRKLEG

AF_AF2227 TELISYFGTTLSPGLLLLKAGLTSVYSACKTGRGEIIVAIRSFSRYAMDIARRELEIAES

: : ::: * : *.* * * : . .* .
MA_MA4404 VDLAGCITIGEIDEFLLGAPVETGKFGVAVVGGINGICALEETGIEIETNPISMMLDYRT

MMZ_MM1085 VGLAGCITLGEIDEYLLGAPVETGKFGAAVVGGINGICALEETGIEIETNPISTMLDYQT

MB_NrpR VGLAGYYPLGEVDETLFGAPVETGKFGIAIVGGINGICALEETGIKMKTNPVSTVMEYNT

MCB_063_0041 SGLGNVMNIGSSAYDLCGAPVEEGLSGILVGVGVNMISAVEEAGIPVSTSPVSTVLDYKV

MB_NrpR2 AGFSGILEVGEPNTRVLDVPIERDHLGIVVIGGTNPMAVVQEYGIAIDTSAMSRLISFKE

MMZ_MM1969 AGFSGILEVGEPNTRVLDVPIERDHLGIVVIGGTNPMAVVQEYGIPIDTSAMSRLISFKE

MA_MA0822 AGFSGILEVGEPNTRVLDIPIERDHLGIVVIGGTNPMAVVQEYGIPIDTSAMSRLIPFKE

MCB_070_0278 AGLSGIMEVGEPNTRVLDVPVERDHLGVVVIGGTNPMAMAKEQGFEISTSAMSALIGIDS

MK_MK0337 ADIRGIVDVPKVEGEILGIPLPPRSLGIVAYGGLVPVALLEERGISTRTYPTRTLVEYSS

MMs_nrpR_ --LNSVLAYGT--ENVLGMNLNPEQIGVVLVGGLTPLCVPHESGYTADISAATQLKDISS

MJ0159 --LKCIISYGT--ENVLGLDVGDDKVGVALIGGLTPIAPFVENNYCVEICPMSSIVRLES

MTH1569 IGISGVLKVGEPGEDVLGVPVADGMVGVAIIGGITPLCAIQEAGYRAEIKLAENLIEFQS

AF_AF2227 KGLRGVIKILHPSDRIFGLPAAN-RARLVVSAGLNMIAPLFENGIIPEVRVNEFFVDFRD

: : . * :. * . .

MMZ_MM1085 MKEI--------------------------------------------------------

MB_NrpR MTEI--------------------------------------------------------

MCB_063_0041 MSK---------------------------------------------------------

MB_NrpR2 MSRIEDLV----------------------------------------------------

MMZ_MM1969 MSRIEDLV----------------------------------------------------

MA_MA0822 MSRIEDLV----------------------------------------------------

MCB_070_0278 MKHIEDLI----------------------------------------------------

MK_MK0337 LEDARRY-----------------------------------------------------

MMs_nrpR_ MEKKTKGFLEAKKKKGK--FKVTPVLSKMLSKMQTINYDIEDKKGNVVVNTAKIPIEYKE

MJ0159 LHKLKKNPRDIVTKKAN--IRIKTALSKMFNAMAKVTYDIDEADGDVIVNTAFIDKKYLD

MTH1569 LKPLVKPERKLMVSAPERGVKVRFLLSKAWNLINRVDLNPEDLSGRVIANISLISRDDLD

AF_AF2227 FRVI--------------------------------------------------------

:
MA_MA4404 ------------------------------------------------------------

MMZ_MM1085 ------------------------------------------------------------

MB_NrpR ------------------------------------------------------------

MCB_063_0041 ------------------------------------------------------------

MB_NrpR2 ------------------------------------------------------------

MMZ_MM1969 ------------------------------------------------------------

MA_MA0822 ------------------------------------------------------------

MCB_070_0278 ------------------------------------------------------------

MK_MK0337 ------------------------------------------------------------

MMs_nrpR_ EAINALKDSYENKLAIS-DRL-KVECDDKFLNAYTICSLTVDGVFLKNKIPVIPYYGGIL

MJ0159 EAFDILKEAYKKGLGIS-DRFGIVEENDR-IKIQTICAVTLDGIFLRNSVPLIPKYGGIL

MTH1569 YALEVIGQVLSERPEFSTLPMIGVTDEGGMAGIATVCSLTLDGVLIKSGIMSTPKYGGLL

AF_AF2227 ------------------------------------------------------------

MA_MA4404 ------------------------------------------------------------

MMZ_MM1085 ------------------------------------------------------------

MB_NrpR ------------------------------------------------------------

MCB_063_0041 ------------------------------------------------------------

MB_NrpR2 ------------------------------------------------------------

MMZ_MM1969 ------------------------------------------------------------

MA_MA0822 ------------------------------------------------------------

MCB_070_0278 ------------------------------------------------------------

MK_MK0337 ------------------------------------------------------------

MMs_nrpR_ EVKADKKRFIEAIDYEGTSLDPHEVFFNK--------ADGKNYILAGIRKVPMSASEKLI

MJ0159 EITEDKERFIDIIGYDGSSLDPHEVFFNF--------VDCEKTFLAGFREVHRVAREKLE

MTH1569 EVGGRAPRFVELTAYSGSSLDPHEIYVSKNMTAVLEALNGQGRVLASLREVPYLARDHAE

AF_AF2227 ------------------------------------------------------------

MA_MA4404 ------------------------------------------------------------

MMZ_MM1085 ------------------------------------------------------------

MB_NrpR ------------------------------------------------------------

MCB_063_0041 ------------------------------------------------------------

MB_NrpR2 ------------------------------------------------------------

MMZ_MM1969 ------------------------------------------------------------

MA_MA0822 ------------------------------------------------------------

MCB_070_0278 ------------------------------------------------------------

MK_MK0337 ------------------------------------------------------------

MMs_nrpR_ ELNEKLGWN--SIIEIGRPNNDICGVRVEKCMFGITTIGGTNPFANIRKNNIPVEMKTLH

MJ0159 EVLKKLNWN--GIKAIGEPNNELYGIGVNKDMCGVVTMGGINPLVLLKENEIPIELKAMH

MTH1569 GLIEELSEAGFSVLKIGVPGEILYNARVEKYHAGIVTPGGLNPLAAVREAGVEIRMKAIE

AF_AF2227 ------------------------------------------------------------

MA_MA4404 --------------

MMZ_MM1085 --------------

MB_NrpR --------------

MCB_063_0041 --------------

MB_NrpR2 --------------

MMZ_MM1969 --------------

MA_MA0822 --------------

MCB_070_0278 --------------

MK_MK0337 --------------

MMs_nrpR_ KSIDYSELTHYDDI

MJ0159 EVVRFSDLKSYKEI

MTH1569 RLMDLREFRYVDEV

AF_AF2227 --------------

Изменения в оперонной структуре

Поиск ортологов показал, что такие организмы, как Archaeoglobus fulgidus, Methanococcoides burtonii, Methanocaldococcus jannaschii не имеют генов нитрогеназы, и, следовательно, не могут фиксировать молекулярный азот и нуждаются в присутствии ионов аммония. Как правило, гены, кодирующие нитрогеназу, объединены в nif оперон. Интересно, что кроме генов нитрогеназы в состав этого оперона входят гены nifI1 и nifI2, кодирующие белки из РII семейства. Однако в геноме Methanopyrus kandleri из nif генов присутствуют только nifH и nifD, которые не образуют оперона. Кроме того, в этом геноме нет генов nifI1 и nifI2, а ген glnA, который в других геномах расположен отдельно, образует оперон с геном nrpR.

Гены glnB и glnK почти всегда образуют один оперон с amtB (Gelfand et al, 2000). При этом в пределах этих оперонов наблюдаются множественные дупликации как amtB, так и glnB. Подобная ситуация наблюдается в геномах M.maripaludis и M.acetivorans. Однако в геномах M.barkeri и M.kandleri присутствуют также одиночные гены amtB и glnB ( Рис.6).

Рис. 6. Оперонные структуры генов азотофиксации исследуемых геномов. Гены показаны в виде стрелок, регуляторные сайты (по Gelfand et al., 2000) обозначены прямоугольниками. Расстояния до старта трансляции первого гена оперона указаны над сайтом.

a) Methanococcus maripaludis

-80 -47 nifH glnBa glnBb nifD nifK nifE nifN nifX

-46 glnA

glnK1 amtB glnB glnK amtB

b) Methanocaldococcus jannaschii

amtB glnB -70 -54 glnA

amtB -92 glnB

nifH

Рис. 6. Продолжение

c) Methanobacterium thermoautotrophicum delta H

nifH glnBa glnBb nifD nifK nifE nifN

28

glnA -50

-73 amtB glnB -7 amtB glnB

nifH

nifE

d) Methanosarcina mazei

nifH glnBa glnBb nifD nifK nifE nifN


amtB

amtB glnB

glnA


nifH2


glnA
e) Methanococcoides burtonii

glnA

glnB

amt

Рис.6. Продолжение

f) Methanosarcina acetivorans

nifI2 vnfH nifI1 nifI2 vnfG vnfK vnfK vnfE vnfN


nifH nifI1 nifI2 nifD nifK nifE nifN

glnK amtB amtB

amt glnB

antK anfG anfD nifI1 nifI2


glnA


vnfE vnfN nifH


g) Methanopyrus kandleri

MK0337 glnA

nifH

nifD

AmtB MK0054

glnB

h) Archaeoglobus fulgidus

amt2 glnB3 amt3 glnB2

amt1 glnB1


glnA

В процессе изучения оперонной структуры генов азотофиксации было обнаружено большое число дупликаций. Эволюцию дуплицирующихся генов в пределах исследуемых организмов можно последить по филогенетическим деревьям, построенным для каждой группы дуплицировавшихся генов в отдельности.

Многочисленные дупликации наблюдаются для генов, кодирующих субъединицы транспортера аммония (amtB) и регуляторные белки семейства РII: glnB, glnK, nifI1, nifI2 (Рис.7-8).

Рис. 7. Филогенетическое дерево AmtB белков-транспортеров аммония.

Условные обозначения: MTH-Methanobacterium thermoautotrophicum, MMZ-Methanosarcina mazei, MJ-Methanocaldococcus jannaschii, MA-Methanosarcina acetivorans, MK-Methanopyrus kandleri, MM-Methanococcus maripaludis, MCB-Methanococcoides burtonii, AF-Archaeoglobus fulgidus, MB-Methanosarcina barkeri. Зеленым отмечены гены, в промоторных областях которых обнаружены регуляторные сигналы.

Рис.8. Филогенетическое дерево белков семейства PII. Условные обозначения: MTH-Methanobacterium thermoautotrophicum, MMZ-Methanosarcina mazei, MJ-Methanocaldococcus jannaschii, MA-Methanosarcina acetivorans, MK-Methanopyrus kandleri, MM-Methanococcus maripaludis,MCB-Methanococcoides burtonii, AF-Archaeoglobus fulgidus, MB-Methanosarcina barkeri. Зеленым отмечены гены, в промоторных областях которых обнаружены регуляторные сигналы.

В геноме M.acetivorans дупликации на раннем этапе эволюции и последующей модификации подверглись гены, кодирующие субъединицы нитрогеназы, в результате чего в организме присутcтвуют три типа нитрогеназ:

• 
  молибден-зависимая нитрогеназа NifHDKEN
  
• 
  ванадий-зависимая нитрогеназа VnfHDKEN
  
• 
  нитрогеназа AnfDK, не содержащая ни молибденового , ни ванадиевого кофактора Аннотация генов vnf и anf была проведена ранее биоинформатическими методами. (Galagan et al, 2002).
  

Филогенетическое дерево для белков, являющихся составными частями нитрогеназы, представлено на Рис.9.
Рис. 9. Филогенетическое дерево nif генов, кодирующих субъединицы нитрогеназы.

Условные обозначения: MTH-Methanobacterium thermoautotrophicum, MMZ-Methanosarcina mazei, MJ-Methanocaldococcus jannaschii, MA-Methanosarcina acetivorans, MK-Methanopyrus kandleri, MM-Methanococcus maripaludis, MCB-Methanococcoides burtonii, AF-Archaeoglobus fulgidus, MB-Methanosarcina barkery. Зеленым отмечены гены, в промоторных областях которых обнаружены регуляторные сигналы.

Интересно, что в первых двух случаях полностью сохраняется структура оперонов, кодирующих субъединицы денитрогеназ, что наводит на мысль о происхождении их путем дупликации первоначального оперона (Рис.6f).

Белки регуляторного каскада.

В археях отсутствуют все гены, кодирующие белки регуляторного каскада, характерного для бактерий, кроме генов, кодирующих белки семейства РII (Dixon and Kahn, 2004). Это объясняется принципиально различным механизмом регуляции у архей и эубактерий. В то время, как в бактериях экспрессия генов азотофиксации регулируется по принципу активации энхансер-связывающими белками, в археях эта регуляция осуществляется по принципу репрессии при помощи NrpR белка.

Известно, что белки РII семейства необходимы для быстрой посттранскрипционной регуляции азотофиксации, которая защищает клетку от затрат энергии, когда концентрация внутриклеточного аммония слишком высока (Kessler et al, 2002). В бактериях посттранскрипционная регуляция азотофиксации осуществляется за счет ковалентного ADP-рибозилирования железосодержащего белка, входящего в состав нитрогеназы. К сожалению, неизвестно, существует ли подобный механизм регуляции в археях, однако для M.maripaludis было показано, что для подобной регуляции необходимо присутствие не только GlnB и GlnK, как в бактериях, но и двух других членах этого семейства NifI1 и NifI2. Наличие этих двух белков в геноме характерно только для архей. ADP-рибозилирование железосодержащего белка нитрогеназы для архей не было установлено (Dixon and Kahn,2004).

В то время как GlnB и GlnK близки по структуре к бактериальным белкам семейства PII, что выражается в наличие сайта уридинилирования и строении Т-петли - специфической последовательности, отвечающей за связывание с эффектором (Yiang et al, 1997). NifI1 и NifI2 не имеют сайта уридинилирования, а по строению Т-петли отличаются от других гомологов и между собой (Kessler et al, 2002). Все это указывает на то, что механизм посттранскрипционной регуляции в археях происходит иначе, чем в организме бактерий.

Нами было показано,что гены nifI1 и nifI2 располагаются в одном опероне с генами субъединиц нитрогеназ, nif опероне. Исходя из этого, можно предположить, что они необходимы для посттранскрипционной регуляции фиксации молекулярного азота. Гены amtB, glnB и glnK также образуют один оперон, из чего можно сделать предположение, что GlnB и GlnK участвуют в регуляции транспорта аммония через плазматическую мембрану. Мы предполагаем, что при увеличении внутриклеточной концентрации глутамина, а значит, связанного азота, GlnB и GlnK находятся в активном состоянии и блокируют каналы-транспортеры аммония, продукты генов amt. При уменьшении же концентрации аммония уридилтрансфераза уридинилирует GlnB и GlnK, в результате чего они теряют способность к связыванию с каналом (Рис.10).

Аммоний

Рис.10. Регуляция транспорта

аммония через плазмати-

ческую мембрану клетки. AmtB

При увеличении концентра-

ции внутриклеточного

азота “свободный” регу-

лятор закрывает канал-транс-

портер. При низкой - уридил- Концентрация глутамина

трансфераза инактивирует

регулятор, который теперь

не может связываться с каналом.
Уридилтрансфераза UMP
GlnB или

GlnK

Поиск потенциальных регуляторных сайтов

Ранее биоинформатическими методами был определен регуляторный сигнал для NrpR, представляющий собой палиндром длиной18 нуклеотидов. Сайты такого вида были обнаружены пред генами, участвующими в азотофиксации, в геномах M.thermoautotrophicum, M.jannaschii и M.maripaludis. (Gelfand et al, 2000). Для того, чтобы более полно охарактеризовать структуру данного регуляторного сигнала, нами была построена диаграмма логo на основе всех сайтов, найденных перед генами азотофиксации в этих трех геномах. Как видно из Рис.11, данный сайт представляет собой инвертированный повтор длиной 16 нуклеотидов и имеет спейсер из 6 нуклеотидов.(Рис.11) Этот результат отличается от полученного ранее экспериментальными методами, согласно которому регуляторный сигнал имеет строение GGTT-(6)-AACC (Kessler and Leigh, 1999), а так же не согласуется и с ранее полученными биоиформатическими данными, согласно которым этот сайт представляет собой палиндром из 18 нуклеотидов (Gelfand et al, 2000). Из составленной нами диаграммы лого видно, что крайние позиции не являются информационно значимыми. Поэтому есть основание предполагать, что регуляторный сигнал азотофиксации в геномах M.thermoautotrophicum, M.jannaschii, M.maripaludis представляет собой инвертированный повтор длиной 16 нуклеотидов с консенсусом mGGAAr-6-yTTTCCk.

Рис. 11. Лого для сайта связывания NrpR. По горизонтальной оси указан номер позиции сайта связывания, по вертикальной – информационное содержание позиции. Высота столбца пропорциональна информационному содержанию данной позиции, относительная высота каждой буквы соответствует частоте нуклеотида в данной позиции.




Поиск регуляторного сигнала в других геномах

На основании филогенетического дерева ортологов NrpR была выделена группа организмов, обладающих высокой степенью сходства ортологов, а, следовательно, и регуляторных сигналов. В эту группу вошли геномы M.mazei, M.acetivorans, M.burtonii, M.barkeri. Поскольку ортологи NrpR из этих организмов содержат ДНК-связывающий и предполагаемый димеризующий домены, то можно предположит, что общий механизм взаимодействия регулятора с ДНК не изменился. Из чего можно сделать вывод, что следует искать регуляторный сигнал палиндромного строения.

Первоначально нами была осуществлена попытка поиска предполагаемых сайтов с использованием метода генетического футпринтинга. На основании промоторных областей всех генов, предположительно относящихся к регулону азотофиксации, Было построено множественное выравнивание 5-областей всех генов, предположительно относящихся к регулону азотофиксации. Однако на нем не было обнаружено продолжительных консервативных последовательностей.

Исходя из предположения, что во всех исследуемых организмах сайт связывания NrpR имеет палиндромное строение, с помощью программы SignalX был произведен поиск палиндромов различной длины (от 12 до 18) в регуляторных областях генов, участвующих в фиксации азота. Однако нам не удалось найти потенциальных сигналов, которые бы сохранялись перед ортологичными генами в разных геномах.

Взаимодействие NrpR-ДНК происходит путем связывания с плечами палиндрома НТН-доменов димера. Другие два домена, связываясь с соответствующими доменами второй субъединицы, образуют “мостик” между НТН-доменами над спейсерным участком регуляторного сигнала. В регуляторах исследуемой нами группы сохраняется только один ДНК-несвязывающий домен, что могло привести к укорочению длины “мостика”, а соответственно и спейсера. Таким образом, предполагая, что консенсус плечей палиндрома являетсясходным в исследуемых геномах, а длина спейсера изменяется, мы составили консенсус на основании уже известного регуляторного сигнала. Изменяя длину спейсера от 6 до 0 мы проводили поиск в исследуемых геномах, однако не удалось обнаружить потенциальных сигналов, сохраняющихся в разных геномах перед ортологичными генами.


Выводы:

1. 
   Проведено исследование регуляции азотофиксации в различных группах архей с помощью методов сравнительной геномики.
   
2. 
   Обнаружен ряд гомологов регуляторного белка NrpR. Показаны отличия в строении гомологов, косвенно указывающие на возможные различия в механизме регуляции азотофиксации.
   
3. 
   Обнаружены множественные дупликации генов, кодирующих субъединицы транспортера аммония (amt) и белки, регулирующие транспорт аммония (glnB, glnK).
   
4. 
   В геноме M.acetivorans обнаружены дупликации генов, кодирующих субъединицы нитрогеназы.
   
5. 
   На основании анализа оперонной структуры в различных геномах выдвинута гипотиза о роли различных белков PII семейства в регуляции азотофиксации.
   
6. 
   Подтверждена структура регуляторного сайта в геномах M.thermoautotrophicum, M.jannaschii и M.maripaludis.
   
7. 
   В других геномах обнаружить потенциального регуляторного сайта не удалось.
   

Список литературы.
Altschul S.F, Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D.L.. (1997) Gappend BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 17: 3389-3402
Aravind L. and Koonin E.V. (1999) DNA-binding proteins and evolution of transcription regulation in the achaea. Nucleic Acids Research, Vol. 27, No. 23: 4658-4670
Atchley W.R., Rosinski J.A. (1999) Molecular evolution of helix-tern-helix proteins. J Mol Evol 49: 301-309

Bell S.D. and Jackson S.P. (1998) Transcription in Archaea. In “Mechanisms of transcription”, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Bult C.J., White O., Olsen G.J., Zhou L., Fleischmann R.D., Sutton G.G., Blake J.A., FitzGerald L.M., Clayton R.A., Gocayne J.D., Kerlavage A.R., Dougherty B.A., Tomb J.F., Adams M.D., Reich C.I., Overbeek R., Kirkness E.F., Weinstock K.G., Merrick J.M., Glodek A., Scott J.L., Geoghagen N.S., and Venter J.C. (1996) Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii. Science. 273 (5278): 1058-1073.

Cohen-Kupiec R., Blank C., and Leigh J.A. (1997) Transcriprional regulation in Archaea: In vivo demonstration of a repressor binding site in a methanogen. Proc. Nacl. Acad. Sci. 94: 13475

Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.-M., and brenner S.E.. (2004) WebLogo: a sequence logo generator. Cold Spring Harbor Laboratory Press ISSN 1088-9051/04 14:1188-1190

Deppenmeier U., Johann A., Hartsch T., Merkl R., Schmitz R.A., Martinez-Arias R., Henne A., Wiezer A., Baumer S., Jacobi C., Bruggemann H., Lienard T., Christmann A., Bomeke M., Steckel S., Bhattacharyya A., Lykidi A., Overbeek R., Klenk H.P., Gunsalus R.P., Fritz H.J., and Gottschalk G. (2002) The genome of Methanosarcina mazei: evidence for lateral gene transfer between bacteria and archaea. J Mol Microbiol Biotechnol. 4 (4): 453-461.

Dixon R. and Kahn D.. (2004) Genetic regulation of biological nitrogen fixation. Nature Reviews, Microbiology, Vol. 2: 621

Doolittle W.F. and Brown J.R. (1994) Tempo, mode the progenote, and the universal root. Proc. Natl. Acad. Sci 91: 6721

Galagan J.E., Nusbaum C., Roy A., Endrizzi M.G., Macdonald P., FitzHugh W., Calvo S., Engels R., Smirnov S., Atnoor D., Brown A., Allen N., Naylor J., Stange-Thomann N., DeArellano K., Johnson R., Linton L., McEwan P., McKernan K., Talamas J., Tirrell A., Ye W., Zimmer A., Barber R.D., Cann I., Graham D.E., Grahame D.A., Guss A.M., Hedderich R., Ingram-Smith C., Kuettner H.C., Krzycki J.A., Leigh J.A., Li W., Liu J., Mukhopadhyay B., Reeve J.N., Smith K., Springer T.A., Umayam L.A., White O., White R.H., Conway de Macario E., Ferry J.G., Jarrell K.F., Jing H., Macario A.J., Paulsen I., Pritchett M., Sowers K.R., Swanson R.V., Zinder S.H., Lander E., Metcalf W.W., and Birren B. (2002) The genome of M. acetivorans reveals extensive metabolic and physiological diversity. Genome Res. 12 (4): 532-542.
Gelfand M.S., Koonin E.V., Mironov A.A. (2000) Prediction of transcription regulatory sites in Archaea by a comparative genomic approach. Nucleic Acids Res.

Kessler P.S., Daniel C., and Leigh J.A.. (2000) Ammonia switch-off of nitrogen fixation in the methanogenic archaeon Methanococcus maripaludis: mechanistic features and tequirement for the novel GlnB homologues, NifI₁ and NifI_2.Department of Microbiology, University of Washington, Seattle, Washington 98195 Received 10 July 2000/Accepted 7 November 2000

Lie T.J., Leigh J.A.( 2002) A novel repressor of nif and glnA expression in the methanogenic archaeon Methanococcus maripaludis. J Bacteriol. 184. 5301-5306

Mironov A.A., Koonin E.V., Roytberg M.A., Gelfand M.S. (1999) Computer analysis of transcription regulatory patterns in completely sequenced bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 27. 2981-2989.

Mironov A.A., Vinokurova N.P., Gelfand M.S. (2000) Software for analyzing bacterial genoms. Mol Biol (Mosk). 34. 253-262

Smith D.R., Doucette-Stamm L.A., Deloughery C., Lee H., Dubois J., Aldredge T., Bashirzadeh R., Blakely D., Cook R., Gilbert K., Harrison D., Hoang L., Keagle P., Lumm W., Pothier B., Qiu D., Spadafora R., Vicaire R., Wang Y., Wierzbowski J., Gibson R., Jiwani N., Caruso A., Bush D., and Reeve J.N. (1997) Complete genome sequence of Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH: functional analysis and comparative genomics. J Bacteriol. 179 (22): 7135-7155.

Гельфанд М.С., Миронов А.А. (1999). Компьютерный анализ регуляторных сигналов в полных бактериальных геномах. Молекулярная биология. Т.33. С 772-778