Литература 1 Baulcombe D. Rna silencing in plants // Nature. 2004. V. 431. P. 356-363
жүктеу/скачать 370.9 Kb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Результаты и их обсуждение
| Материалы и методы
В работе был использован фермент инвертаза (К.Ф. 3.2.1.26.) Saccharomyces cerevisiae (Sigma- Aldrich, USA); в работе впервые изучены процессы биодеградации инулина топинамбура сорта Файз барака. Гидролитическую активность инвертазы определяли в два этапа [7]. На первом этапе смешивали 0,50 мл (1 мг) раствора фермента, 0,50 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,0) и 1,0 мл 0,20% инулина и смесь инкубировали в течение 10 мин при 50 0 С. Реакцию останавливали выдерживанием в кипящей водяной бане в течение 5 мин. Контролем при определении активности фермента инвертазы служил раствор фермента, который предварительно инактивировали кипячением в водяной бане в течение 5 мин. Количество образовавшейся глюкозы в реакционной смеси определяли по методу [8]. За единицу активности инвертазы принимали такое количество фермента, которое катализировало образование 1 мкг глюкозы за 1 минуту. Количество ферментного белка определяли по методу Лоури [9]. Результаты и их обсуждение По литературным данным рН оптимум инвертазы зависит от источника выделения. Так, например, у дрожжей она составляет 4,0-5,0 [10]. Оптимальная температура инвертазы также зависит от источника фермента. Обычно оптимум находится в интервале 30-60 0 С и температурный оптимум повышается с увеличением концентрации субстрата. Например, температурным оптимумом инвертазы для нативной и иммобилизованной ферментов Saccharomyces cerevisiae является 50 0 С и 30 0 С соответственно [11]. При исследовании рН оптимума нативной дрожжевой инвертазы в качестве субстрата применяли 1% раствор инулина в диапазоне рН от 3,0 до 6,0. На рисунке 1. представлена кривая рН-оптимума нативной инвертазы. рН оптимум нативной инвертазы находится в области рН 4,0. Оптимальное время инкубации нативной инвертазы в водной среде находили по накоплению глюкозы и фруктозы в реакционной смеси (рисунок 2). Из рисунка 2 видно, что через 1 час наблюдается максимальная активность нативного фермента (360 Ед). Дальнейшее увеличение времени инкубации не влияло на увеличение глюкозы и фруктозы в среде и приводило, соответственно, к падению активности фермента. При определении оптимальной концентрации субстрата нативной инвертазы водной среде в качестве субстрата применяли инулин. Зависимость активности инвертазы от концентрации инулина в среде измеряли в диапазоне ее концентраций от 0,025 до 2,5% (рисунок 3). Максимальная активность (360 Ед) нативного фермента отмечены в 1,0-1,15% растворах инулина. Температурный оптимум является одним из лимитирующих факторов протекания ферментативных реакций. Определение температурного оптимума действия фермента в водной среде проводили в интервале температур от 20 до 50 0 С, используя в качестве субстрата 1% инулин при установленных рН-оптимумах инвертазы. Температурный оптимум фермента находится в области 50 0 С. Результаты проведенных исследований представлены на рисунке 4. Стабильность инвертазы изучали измерением активности фермента в процессе преинкубации в 0,1М ацетатном буфере рН 4,0 (рисунок 5). 136 ____________________________________________________________________________________ Вестник КазНУ. Серия биологическая. №3/1(59). 2013 жүктеу/скачать 370.9 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|