Медико-химические подходы к направленному поиску препаратов для лечения и предупреждения болезни альцгеймера

Очевидно, что одними из наиболее привлекательных участков для действия препаратов, блокирующих развитие каскада нейродегенеративных процессов, является стадия образования АРb из белка предшественника АРР. Как уже отмечалось ранее, процессинг АРР регулируется активацией мХР, опосредуемой через протеинкиназы, а экспрессия АРР стимулируется рядом эндогенных факторов, в т.ч. цитокинами, некоторыми нейротрофическими факторами (BFGF, EGF), эстрогенами, стрессовыми условиями (травма, фокальная ишемия др.) [16]. Известно, что процесс формирования АРb включает две стадии: внутриклеточный протеолиз под действием b-секретаз, формирующий амино-терминальный остаток АРb, и экстраклеточное расщепление под действием g-секретаз по С-терминальному остатку АРb [19]. Еще до недавнего времени достоверных сведений о природе и свойствах истиных b- и g-протеаз, выщепляющих АРb из белка предшественника не имелось. В конце 1999 г. появилось первое сообщение об идентификации b-секретазы участвующей в процессинге АРb [20], что дает основание для направленного поиска специфических блокаторов этого процесса. В отношении гамма-секретазы такой ясности пока нет. В качестве вероятных кандидатов на эту роль рассматривались различные известные протеазы, в том числе кальпаин, катепсин D. Высказано предположение, что нейропротекторные свойства церебролизина (Cerebrolysin) в существенной мере определяются его свойствами ингибитора кальпаина II. Твердо установлено, однако, что определяющую роль в обеспечении активности этого фермента играет белок пресинилин I, что может быть использовано для поиска нейропротекторных препаратов направленных на блокаду патологического процессинга АРР [21].

В литературе имеется много данных, полученных, как правило, на культуре клеток, о возможности регуляции образования АРb химическими агентами (структурные формулы некоторых соединений подобного действия приведены на рис. 5). Механизм действия этих соединений, однако, существенно различается. Так, монензин (Monensin) и брефелдин А (Brefeldin A), по всей видимости, снижают образование АРb путем дестабилизации рН-градиента и/или везикулярного транспорта. Понятно, что подобная неселективность в механизме действия делает маловероятным создание на их основе реальных терапевтических средств. Значительно больший интерес привлекает бафиломицин (Bafilomycin A) и его аналоги, которые высокоэффективно (EC50=50нM) и селективно блокируют образование АРb по механизму опосредованного ингибирования b-секретазной активности, предотвращая лизосомальное подкисление путем ингибирования АТФ-азы V-типа. Другой механизм, приводящий к понижению образования АРb, реализуют соединения пептидной природы MDL-28170, леупептин (Leupeptine) и E-64, которые стабилизируют С-терминальный фрагмент АРb путем прямого или косвенного ингибирования g-секретазной активности. Недавно появилась первая публикация о возможности эффективного ингибирования функциональной активности g-секретазы и снижения уровня АРb в мозге в экспериментах in vivo на трансгенных мышах [22]. В качестве ингибиторов наиболее эффективными оказались эфиры N-арил-аланина.

Рисунок 5.

Интересной альтернативой указанным направлениям ингибирования патологического процессинга АРР является действие препаратов, стимулирующих нормальное расщепление АРР с образованием трофической формы sAPPa. Так, установлено, что стимуляция 1a подтипа метаботропных глутаматных рецепторов увеличивает образование sAPPa, что может быть использовано в качестве рациональной стратегии предотвращения развития АРb-индуцируемой патологии альцгеймеровского типа [23].

Переход АРb из растворимой в агрегированную форму считается обязательным условием проявления им нейродегенеративных свойств. В этой связи, средства, замедляющие или обращающие этот процесс, могут рассматриваться в качестве потенциальных анти-альцгеймеровских препаратов с нейропротекторным типом действия. Предполагается, что в основе процесса фибрилизации АРb лежит способность этой формы амилоида образовывать b-складчатые олигомерные структуры [24]. Поэтому естественным представляется направленный поиск веществ, способных препятствовать формированию b-складчатых агрегатов (т.н. "b-sheet breaker"). Показано, что подобные свойства проявляют ряд синтетических пептидов, представляющих сокращенные или модифицированные варианты самого АРb. В частности, пентапептид KLVFF, являющийся фрагментом АРb с последовательностью аминокислот 16-20, а также ряд его модифицированных аналогов: LPFFD, LPYFD, RDLPFYPVPID [25]. Главным недостатком этих соединений в плане их практического использования является слабое проникновение в мозг через ГЭБ, что отмечают сами авторы, а также возможные побочные (в частности, аллергические) реакции.

Среди веществ не пептидной природы, способных уменьшать агрегацию и депонирование фибриллярных образований АРb в мозге, необходимо отметить ряд синтетических глюкозаминогликанов и эндогенных протеогликанов. В частности, установлено, что гликопротеин ламинин (Laminin), экспрессируемый в мозге после травм, а также некоторые его производные в опытах на культуре клеток ингибируют образование b-фибрилл и индуцируют их дезагрегацию. Аналогичные свойства проявляют ряд вновь синтезированных бензофуранов, антибиотик рифампицин (rifampicin), применяемый при лечении туберкулеза и проказы, некоторые производные тетрациклинового ряда, в частности, ролитетрациклин (rolitetracycline), дауномицин (daunomycin), которые связываются с АРb и таким образом блокируют процесс образования амилоидных фибрилл. С помощью докинг-моделирования установлено, что эти вещества способны формировать сходный трехмерный фармакофор, который, по всей видимости, участвует во взаимодействии с АРb [26].

В последние годы появились работы, указывающие на участие ферментов класса ХЭ в процессе агрегации. В частности, показано, что АХЭ ускоряет переход растворимого АРb в фибриллярные комплексы, при этом существенную роль играет взаимодействие АРb с перифирическим центром связывания АХЭ. Интересно, что образующийся при этом комплекс АХЭ-АРb сам обладает нейротоксическими свойствами, причем наиболее токсичен комплекс с формой АРb40 [6]. В этой связи возникает новый аспект терапевтического действия ингибиторов АХЭ, поскольку блокируя взаимодействие этого фермента с АРb они могут выступать в качестве нейропротекторов.

Значительной интерес привлекают исследования эндогенных механизмов регуляции процесса образования амилоидных фибрилл, в первую очередь, роли и функции аполипопротеина Е (apoЕ) в этом процессе. Известно, что белок apoЕ существует в нескольких изоформах (Е2, Е3, Е4) и играет ключевую роль в метаболизме липидов и липопротеинов. Установлено, что наличие аллели e4 АРОЕ гена является одним из важнейших генетических факторов риска БА. В качестве одного из возможных механизмов реализации нейродегенеративно-инициирующих свойств apoЕ4 рассматривается его способность усиливать фибрилогенез АРb и снижать его выведение из межклеточного пространства [27, 28]. С другой стороны, недавно получены веские основания предполагать наличие протекторных функций у белка apoJ, который стимулирует накопление в ЦНС трофической формы амилоида sAPPa [29]. Возможность воздействовать на apoЕ/apoJ-регулируемый процесс формирования и депонирования в мозге амилоидных фибрилл представляется в настоящее время заманчивой, но пока не реализованной на практике стратегией предотвращения развития БА.

Другим направлением поиска способов коррекции патологии типа БА является использование антител к АРb (АТАРb). Сами АТАРb уже давно рассматриваются в качестве вероятного маркера для диагностики БА, однако терапевтические возможности иммунных методов коррекции БА появились лишь в самое последнее время. Сначала в опытах на трансгенных мышах (линии PDAPP, имеющей повышенный уровень продуцирования АРb42 и повышенный уровень отложения амилоидных бляшек) было установлено, что иммунизация амилоидом АРb42 приводит к предотвращению отложения амилоидных бляшек у молодых животных и к существенному снижению уровня бляшек у старых животных [30]. Предполагается, что иммунизация АРb вызывает усиленное образование АТАРb, которые связывают и "выводят" из амилоидных отложений основной их компонент - эндогенный АРb, что инициирует общую дестабилизацию и разрушение сенильных бляшек. Далее, возможность успешного применения антител для предотвращения токсического действия АРb была продемонстрирована в экспериментах с искусственными антителами IgM508 к фрагментам белка АРР. При этом было показано, что подобные антитела способны блокировать образование нерастворимых агрегатов АРb и растворять уже образовавшиеся амилоидные фибрилы [31]. Наконец, в самом конце 2000г. в журнале "Nature" одновременно были опубликованы статьи канадских [32] и американских ученых [33], показавших на различных трансгенных линиях мышей, что иммунизация животных пептидом АРb препятствовала снижению памяти и отложению амилоидных бляшек у трансгенных (как по одному гену АРР так и по двум генам: АРР и пресенилина-1) животных. Вместе с тем отмечено, что общего снижения уровня АРb в мозге при иммунизации не происходило.

По данным имеющимся в интернете синтетическая форма АРb42 под названием препарат AN-1792 (Elan Corporation) проходит I фазу клинических испытаний.

Таким образом, пока на уровне лабораторных исследований на животных, показана возможность успешного предотвращения и даже обращения процесса формирования амилоидных образований - одной из наиболее характерных патологоморфологических характеристик БА.

Несмотря на то, что до настоящего времени нет полной ясности о молекулярных механизмах, определяющих нейродегенеративное действие АРb в условиях in vivo, имеются основания считать, что токсические эффекты АРb могут реализовываться по следующим основным направлениям:

• 
  усиление токсичности возбуждающих аминокислот (ВАК);
  
• 
  нарушение гомеостаза ионов кальция ([Са2+]i);
  
• 
  инициация перекисного окисления липидов мембран (ПОЛ) и генерация свободно-радикальных метаболитов (СРМ);
  
• 
  индукция апоптоза;
  
• 
  энергетическое истощение клеток.
  

В основе представлений о роли глутаматэргической системы ЦНС в этиопатогенезе БА лежат следующие факты: существенное снижение уровня глутаматных рецепторов (GluR) в области гиппокампа, ключевое значение NMDA-подтипа глутаматных рецепторов в процессах обучения и памяти, способность эндогенного глутамата и других агонистов GluR оказывать нейротоксическое действие на нервные клетки - т.н. явление эксайтотоксичности [34].

Как известно, явление эксайтотоксичности эндогенных ВАК (глутамата и аспартата) и их экзогенных аналогов является результатом гипервозбуждения глутаматных рецепторов в ЦНС. Исследованию механизмов эксайтотоксичности и ее роли в этиопатогенезе нейродегенеративных расстройств посвящено огромное количество литературы, в т.ч. ряд свежих обзорных статей [35]. Суммируя имеющиеся результаты и предположения, можно отметить, что в процессе острой "классической" эксайтотоксичности выделяют три стадии:

• 
  Первичная деполяризация нейрональной мембраны, опосредуемая, вероятно, АМРА-и/или каинатными подтипами глутаматных рецепторов, которая приводит к усиленному входу в клетки ионов натрия (через АМРА и потенциал-зависимые натриевые каналы), ионов хлора и молекул воды, в результате чего проявляется т.н. "осмотическое набухание" клеток и происходит снятие магниевого блока у NMDA-рецепторов. Эта стадия процесса эксайтотоксичности является кальций-независимым процессом.
  
• 
  Гиперактивация NMDA-рецепторов, сопровождающаяся массированным входом в клетки ионов кальция и увеличением концентрации [Са2+]i на несколько порядков, что приводит к активации ряда внутриклеточных ферментных систем (протеаз, нуклеаз, липаз), инициирующих каскад цитодегенеративных процессов и лизис клетки. Этот процесс строго зависит от наличия ионов кальция.
  
• 
  Экзоцитоз клеток, приводящий к массированному выбросу из клеток эндогенного глутамата. В результате этого происходит резкое увеличение концентрации экстраклеточного глутамата, дополнительная гиперактивация глутаматных рецепторов и последующая серия нейродегенеративных реакций клетки (по первому и второму механизму).
  

В начале 90-х годов в опытах на культуре клеток были получены результаты, указывающие на способность АРb потенциировать нейротоксичность ВАК и дестабилизировать кальциевый гомеостаз в клетках [37]. Исходя из этих данных, можно предполагать, что антагонисты АМРА/каинатных рецепторов, а также блокаторы глутамат-индуцированного входа кальция в ряду антагонистов NMDA-рецепторов будут проявлять нейропротекторные свойства также и в отношении АРb. С другой стороны, как уже отмечалось выше, при БА отмечено существенное снижение уровня глутаматных рецепторов, коррелирующее с тяжестью развития этой патологии [38].

Таким образом, поиск эффективных анти-альцгеймеровских препаратов на основе лигандов GluR должен учитывать дуализм функций нейромедиатора-глутамата в ЦНС: агонисты GluR могут улучшать сниженные при БА когнитивные функции за счет компенсации дефицита глутаматэргической иннервации в стриатуме и гиппокампе, но потенциально увеличивать вероятность развития эксайтотоксических процессов. Антагонисты GluR, в частности антагонисты NMDA- и АМРА-рецепторов, будут проявлять выраженные нейропротекторные свойства, но при этом существует вероятность снижения когнитивных функций ЦНС.

Несмотря на указанные проблемы, поиск высокоэффективных средств для лечения и предупреждения БА в ряду лигандов глутаматэргической системы, обладающих оптимальным соотношением нейропротекторных и когнитивно-стимулирующих свойств рассматривается в настоящее время в качестве одного из перспективных направлений фармакотерапии БА. Особое внимание и значение при этом уделяется веществам, действующим на АМРА/каинатные рецепторы [39].

В качестве возможных подходов к реализации глутамат-эргической стратегии терапии БА к настоящему времени сформировались следующие направления:

1. Препараты, сочетающие свойства антагонистов NMDA- и агонистов АМРА- рецепторов. К настоящему времени накоплен положительный опыт использования для лечения БА препарата аканитол мемантин (Akanitol Memantine фирмы Merz). Препарат относится к группе низкоаффинных неконкурентных антагонистов NDMA-рецепторов, а также проявляет свойства агониста АМРА-рецепторов. По последним опубликованным данным о клинических исследованиях мемантина, препарат проявляет положительный эффект у 73% пациентов легкой и умеренной формой деменции альцгеймеровского типа [40]. Мемантин не проявляет нейротоксических эффектов, свойственных неспецифическим антагонистам NMDA-рецепторов, а также побочных эффектов, характерных для холиномиметических средств и разрешен к применению в ряде европейских стран и России. Вместе с тем необходимо отметить, что ряд клиницистов осторожно относятся к перспективам применения мемантина, поскольку основной биомишенью его действия является фенциклидиновый сайт NMDA-канального комплекса, взаимодействие с которым определяет побочные психотомиметические эффекты таких препаратов как дизоцилпин (Dizocilpine, MK-801).

2. Вещества, способные опосредованно стимулировать активацию не NMDA- рецепторов. Другими словами, соединения, не способные проявлять собственную эксайтотоксичность, но усиливающие ответ АМРА/каинатных рецепторов на действие эндогенного глутамата. К числу подобных препаратов можно отнести группу т.н. "ампакинов", соединений, действующих на отдельный сайт АМРА-рецептора и снижающих его десенситизацию за счет положительной модуляции ответов агонистов АМРА-рецептора.

Показано, что препарат СХ516, в испытаниях на пожилых людях существенно улучшает один из показателей когнитивных функций - т.н. "отложенную память" (delayed recall). Ряд его производных и аналогов (в частности, препарат амплекс, Amplex фирмы Cortex), в опытах на лабораторных животных показали даже более высокие когнитивно-стимулирующие свойства чем СХ516 [41]. Вероятно, подобный механизм действия имеют некоторые производные тиомочевины, проявившие высокие когнитивно-стимулирующие свойства на животных моделях БА [42].

3. Соединения, действующие на глициновый участок NMDA-рецептора. В частности, препарат D-циклосерин (D-Сycloserine, фирма Searle), являющийся частичным агонистом глицинового Б-сайта, находился на 2-й фазе клинических испытаний на больных БА.

Помимо указанных стратегических направлений поиска в последние годы получены положительные результаты предварительных клинических испытаний для отдельных препаратов, имеющих выраженную специфичность в отношении глутаматэргической системы ЦНС:

• 
  Препарат сабелюзол (Sabeluzole, R58735 или ReminylTM фирмы Janssen Pharmaceuticals) в опытах на животных и на добровольцах проявил способность улучшать память и обучаемость. Проходил 3-ю фазу клинических испытаний. Проявляет свойства антагониста Glu-R. Нейропротекторное действие препарата связывают с его свойством блокатора глутамат-индуцированного входа кальция и недавно выявленной способностью к стабилизации цитоскелета нервных клеток. В настоящее время, однако, клинические испытания сабелюзола приостановлены.
  
• 
  Отечественный лекарственный препарат димебон (Dimebon), применяемый в отечественной клинической практике как антигистаминное средство. Этот препарат показал выраженную анти-NMDA (ED50 =42 мг/кг в/бр.), антикальциевую активность (IC50=57 мкM) и свойства ингибитора АХЭ и БуХЭ (IC50 = 42 мкM и 7.9 мкM соответственно) в опытах in vitro [43], а также выраженные когнитивно-стимулирующие свойства в экспериментах in vivo на нейротоксической модели БА [44]. К растоящему времени димебон успешно прошел пилотные клинические испытания на больных БА и заявлен в качестве нового средства для лечения БА [45].
  
• 
  Природный гликозид гастродин (Gastrodin). Этот препарат, выделяемый из растения Gastrodia elate и применяемый в китайской медицине, показал в опытах на культуре SY5Y способность блокировать глутамат-индуцированный захват кальция. Рекомендован для дальнейших испытаний в качестве нейропротектора на больных БА и сосудистой деменцией.
  
• 
  Таурин (Taurine) проявляет свойства протектора глутаматной токсичности по механизму блокады глутамат-индуцированного захвата кальция. Интересно, что его близкий аналог b-аланин, наоборот, увеличивает уязвимость нейронов к нейротоксическому действию ВАК и АРb и является т.о. антагонистом протекторного действия таурина.
  

Рисунок 6.

Новым направлением поиска препаратов для терапии нейродегенеративных расстройств, в т.ч. БА, являются лиганды метаботропных глутаматных рецепторов (mGluR), которые в отличие от NMDA и АМРА/каинатных рецепторов не связаны непосредственно с ионными каналами, а участвуют в регуляции внутриклеточного кальция через G-белок и системы вторичных мессенджеров. Выделяют 3 группы mGluR: рецепторы I группы (1 и 5 подтипы mGluR) стимулируют гидролиз фосфоинозитида и связанную с этим процессом мобилизацию ионов Са2+ из внутриклеточных пулов, а рецепторы II (2 и 3 подтипы mGluR) и III групп (4, 6-8 подтипы mGluR) ингибируют аденилатциклазу, что приводит к снижению содержания циклической АМФ. Считается, что активация I группы mGluR увеличивает нейрональное возбуждение, а активация II и III групп снижает возбудимость нейронов [46]. С учетом высокой гетерогенности популяции mGluR и их различной локализации на пре- и пост-синаптической мембране в различных участках мозга становится понятным, почему лиганды mGluR способны проявлять как нейропротекторные, так и нейротоксические свойства. На основании имеющегося в настоящее время большого числа экспериментальных данных, возможно, тем не менее, сделать некоторые предварительные выводы об основных тенденциях в свойствах лигандов mGluR:

Агонисты I типа mGluR - потенциируют эксайтотоксичность, но в то же время стимулируют процессинг АРР с образованием секретируемой формы sAPPa. Антагонисты mGluR-I, как правило, нейропротекторы. Таким образом, роль лигандов этой группы mGluR представляется двойственной.

Агонисты II типа mGluR в большинстве описанных случаев проявляют нейропротекторные свойства, но это зависит во многом от синаптической локализации их рецепторной мишени.

Агонисты III типа проявляют выраженные нейропротективные свойства и по своей функции аддитивны к действию антагонистов NMDA-рецепторов.

В заключении этого раздела отметим оригинальную гипотезу, высказанную недавно автором теории эксайтотоксичности J.W. Olney, рассматривающую БА как результат гипофункции NMDA-рецепторов и предполагающую принципиально новую терапевтическую стратегию поиска анти-альцгеймеровских препаратов на основе соединений, способных блокировать развитие гипофункции этой группы рецепторов [47].

Кальциевая гипотеза старения и деменции и глутаматная теория БА имеют много общего. Ключевым элементом обоих теорий является твердо установленный феномен цитотоксического действия "гипернормальных" концентраций кальция в результате нарушения метаболизма ионов кальция в нервной клетке. В последние годы было показано, что мутация в гене белка пресенилина 1 (PS1) при БА является основным генетическим фактором, определяющим изменение регуляции гомеостаза кальция эндоплазматическим ретикулум в ответ на различные стимулы [48]. С возрастом роль кальций-индуцированной гибели клеток возрастает в связи со значительными потерями в содержании кальций-связывающих белков, в частности, белка кальбиндина (calbindin-D28K) в базальных холинэргических нейронах.

Ранее уже говорилось о возможном механизме нейротоксичности АРb, опосредуемой через кальциевые каналы, связанные с глутаматными рецепторами. Ниже будут рассмотрены основные данные, касающиеся механизмов и способов коррекции действия АРb на потенциал-зависимые кальциевые каналы (ПЗСаК). Хотя исследование молекулярных механизмов кальций-опосредованной нейротоксичности АРb ведется уже давно, до настоящего времени в этом вопросе остается много невыясненных аспектов. В токсическом действии АРb на нервные клетки выделяют, как правило, две стадии: начальную - кальций-независимую фазу, которая может занимать несколько часов, и позднюю - кальций-зависимую стадию, которая развивается в течении нескольких дней [49]. При этом нейротоксичность фрагмента АРb (25-35) эффективно предотвращается блокаторами L-типа, но не блокаторами N- или P/Q- типов кальциевых каналов. Отмечена связь этого процесса с уровнем свободно-радикальных метаболитов (СРМ) в клетках. Показано, что вещества-блокаторы СРМ предотвращали как накопление СРМ, так и потенциал-зависимый вход Ca2+, а специфические блокаторы ПЗСаК оказывали действие только на вход Ca2+, но не влияли на уровень СРМ [50]. Исходя из этого можно предположить, что ранняя (кальций-независимая) стадия токсического действия АРb, регистрируемая по снижению редокс активности внутриклеточных систем, связана с инициацией СРМ и ПОЛ, что, в свою очередь, вызывает нарушение функционирования мембранных механизмов, в частности, деполяризацию ПЗСаК и вход в клетку ионов кальция. Последний процесс является кальций-зависимым и регистрируется как поздняя стадия токсичности АРb. Параллельно этим процессам может идти изменение кальциевой проницаемости глутаматных рецептор-канальных комплексов.

Альтернативой (или дополнительным элементом к) действию АРb на "эндогенные" кальциевые каналы является гипотеза о том, что APb способен сам образовывать новые ("экзогенные") кальций-проницаемые каналы, и т.о. непосредственно вызывать кальций-индуцированную гибель клеток. Хотя до настоящего времени такой механизм действия АРb показан лишь в экспериментах in vitro на модельных системах бислойных липидных мембран [51], теоретическое моделирование структуры подобных АРb-индуцированных кальциевых каналов показывает возможность их формирования в условиях реальных мембран нейронов [52].

Таким образом, есть все основания считать, что практически любые методы, направленные на стабилизацию гомеостаза кальция в нейроне, будут оказывать положительное действие не только на общие процессы старения и гибели клеток, но и на специфическое нейродегенеративное действие АРb.

В этой связи анти-кальциевая стратегия противодействия нейротоксичности АРb представляется вполне обоснованным и перспективным направлением в поиске нейропротекторов для БА.

Помимо уже отмеченных выше препаратов, анти-кальциевое действие которых реализуется путем регуляции глутаматных рецепторов, к числу протекторов кальциевой токсичночти АРb можно отнести соединения действующие на следующие биомишени:

• 
  Блокаторы L-типа кальциевых каналов. В частности, препарат нимодипин (Nimodipin), нейропротекторные и когнитивно-стимулирующие свойства которого показаны на экспериментальных моделях БА и в первичных клинических испытаниях.
  
• 
  Антагонисты рианодиновых (ryanodine) рецепторов, которые играют критическую роль в регуляции интранейронального кальция, будучи ответственны за высвобождение ионов кальция из внутриклеточных пулов.
  
• 
  Селективные агонисты серотониновых рецепторов (5-HT1А), в частности, препарат 8-OH-DPAT, который вызывает гиперполяризацию постсинаптической мембраны и, таким способом, блокирует вход кальция в клетку в результате деполяризации мембраны, индуцированной активацией NMDA-рецепторов либо действием АРb на ПЗСаК.