Методы биологических исследований

CFSE - это вещество, известное также под названием CFDA-SE, представляет собой интернализуемую флуоресцентную метку, способную пассивно проникать внутрь клетки. Само по себе это вещество бесцветно и не флуоресцирует до тех пор пока его ацетатные группы не будут расщеплены внутриклеточными эстеразами. После контакта с эстеразами CFSE превращается в сильнофлуоресцирующее вещество.

Сукцинимидильные группы данного эфира реагирует с внутриклеточными аминами, формируя флуоресцентный конъюгат с белками, который стабилен, хорошо сохраняется и может быть зафиксирован ацетальдегидом. Лишний неконъюгированный реактив и побочные продукты пассивно диффундируют во внеклеточной питательной среде, откуда они могут быть отмыты.

Конъюгат красителя с белками, который формируется в меченных клетках, сохраняется этими клетками в течение всего развития, а также во время мейоза. Поэтому CFSE может быть использован в in vivo исследовании для отслеживания роста и деления клеток. Метка передается дочерним клеткам или после клеточного деления или после слияния клеток, и никогда не передается соседним клеткам в популяции. CFSE позволяет отслеживать деление клеток, так как при делении концентрация метки в дочерних клетках снижается ровно в 2 раза, и интенсивность флуоресценции, соответственно, тоже.

:::::::::::::::::

Авторадиография — метод изучения распределения радиоактивных веществ в исследуемом объекте

Техника исследования

После проявления места затемнения на пленке соответствуют локализации радиоактивных частиц.

Применение

:::::::::::::::::::::

Биотелеметрическая система - комплекс средств для дистанционного измерения различных показателей исследуемого организма.

Классификация биотелеметрических систем

• 
  взаиморасположение объекта исследования и передатчика:
  
  • 
    передатчик находится на небольшом расстоянии от объекта;
    
  • 
    передатчик находится внутри объекта;
    
• 
  взаимоотношение передатчика и приемника: О - передатчик и приемник взаимно неподвижны; 1 - передатчик или приемник перемещаются
  

II. По области применения. Исследуемые системы организма; отрасли биологии и медицины.

Использованная литература:

::::::::::::::::::::

Биуретовый метод

Принцип

К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.

Чувствительность метода — 2-10 мг/мл

:::::::::::::

Бромистый этидий

Под названием Homidium, бромистый этидий использовался для лечения Трипаносомоза у рогатого скота в 1950х годах.

Из-за возможности связывания с ДНК, и при освещении ультрафиолетом, стимулирования разрывов в ДНК, бромистый этидий может быть сильным мутагеном. Также считается канцерогеном и тератогеном, хотя эти свойства никогда не были тщательно исследованы.

Бромистый этидий, EtBr

Спектр поглощения бромистого этидия

Бромистый этидий — интеркалирующий агент, широко применяемый для выявления нуклеиновых кислот в молекулярной биологии, в частности, в случае ДНК электрофореза в агарозном геле.

Агарозный гель, окрашенный бромистым этидием. Визуализация ДНК ультрафиолетом

Вивисекция, живосечение — проведение хирургических операций над живым животным с целью исследования функций организма, изучения механизмов действия лекарственных средств, разработки методов хирургического лечения или же в образовательных целях.

В настоящее время в связи с частым упоминанием опытов на животных в средствах массовой информации далёкие от биологии люди иногда неправильно называют «вивисекцией» любые эксперименты над животными и людьми, приводящие к нарушению здоровья — в частности, проверки на токсичность новых лекарств, косметики, средств бытовой химии, удары электрическим током и т. п).

Когда я приступаю к опыту, связанному в конце с гибелью животного, я испытываю тяжёлое чувство сожаления, что прерываю ликующую жизнь, что являюсь палачом живого существа. Когда я режу, разрушаю живое животное, я глушу в себе едкий упрёк, что грубой, невежественной рукой ломаю невыразимо художественный механизм. Но переношу это в интересах истины, для пользы людям. А меня, мою вивисекционную деятельность предлагают поставить под чей-то постоянный контроль. Вместе с тем истребление и, конечно, мучение животных только ради удовольствия и удовлетворения множества пустых прихотей остаются без должного внимания.

— Иван Петрович Павлов, великий русский физиолог, академик АН СССР, нобелевский лауреат,

Первый в мире закон об ограничении вивисекции, обязательном обезболивании при эксперименте был принят в 1876 году в Великобритании. В Германии вивисекция впервые была запрещена при национал-социалистах по инициативе Г. Геринга, вместо этого проводились хирургические эксперименты на людях — заключённых концлагерей. В 1977 году вышел приказ министра здравоохранения СССР, запрещающий проводить эксперименты на животных без обезболивания.

История

Гален демонстрирует эффект перерезки нервов у свиньи. Иллюстрация из книги 1541 года

Вивисекция известна со II века н. э. Первым, кто применял вивисекцию, считается Клавдий Гален.

Движение против вивисекции

Организации выступающие за ограничения вивисекции

Во Франции первое общество противников вивисекции в XIX веке возглавил Виктор Гюго.

В 1898 году в Великобритании был основан Британский союз за отмену вивисекции.

Известные случаи широкого применения вивисекции людей относятся к периоду Второй мировой войны.

Наибольшую огласку имеют место эксперименты над людьми, проводимые в специальном подразделении японской армии, так называемом Отряде 731, занимавшимся исследованиями, разработкой и внедрением методов ведения бактериологической войны. Вивисекция людей осуществлялась с целью исследования воздействий различных факторов на состояние органов человека. Велись эксперименты как со здоровыми людьми, так и с людьми после воздействия на них поражающих факторов: различных инфекций, отравляющих веществ, низких и высоких температур и т. п. Люди, подвергающиеся вивисекции, являлись этническими китайцами, корейцами, монголами, русскими и представителями других народов, попавшими в плен японской армии либо арестованными по обвинению в шпионаже японской жандармерией. При вскрытии могла не применяться ни местная, ни общая анестезия .

Служащие Отряда 731 успешно применяли в своей медицинской практике после окончания Второй мировой войны знания, приобретённые в период службы в данном подразделении, в том числе полученные при вивисекции людей. Однако значительная часть задокументированных результатов исследований была уничтожена при отступлении частей Квантунской армии в августе 1945 года. Уцелевшие результаты и данные об этих исследованиях были переданы США в обмен на гарантии жизни и свободы руководству и личному составу Отряда 731 со стороны правительства США.

Кроме документов об Отряде 731, есть различные свидетельства, того, что учебные операции на живых людях, оканчивающиеся умерщвлением оперируемого, проводились японскими военными хирургами на всей оккупированной Японией территории

В документальном романе Даниила Гранина «Зубр», основанном на воспоминаниях Тимофеева-Ресовского, имеется примечательное свидетельство об отношении к содержанию животных в фашистском государстве в конце войны:

Норму продуктов в Бухе урезали до голодного минимума. С. Н. Варшавский рассказывал, что им с женой продовольственной карточки и иждивенческой в придачу стало совсем не хватать. То же испытывали и Иван Иванович Лукьянченко, и даже терпеливый ко всему китаец-генетик Ма Сун-юн.

Отдельные части немецкой машины продолжали действовать с нерассуждающей пунктуальностью — подопытным животным аккуратно привозили бумажные мешки с кормом по прежней норме.

— «Зубр» Даниил Гранин

Вивисекция в художественной литературе

::::::::::::::

Гибридома — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния клеток двух видов: способных к образованию антител B-лимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного, и раковых клеток миеломы. Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай. Поскольку раковые клетки миеломы «бессмертны», то есть способны делиться большое количество раз, после слияния и соответствующей селекции гибридома, производящая моноклональные антитела против антигена может поддерживаться долгое время. В 1984 г. за открытие принципа получения моноклональных антител Мильштейн, Кёлер и Ерне получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Гибридомная технология:

:::::::::::::::::::::::::::::

Данио-рерио «Дамский чулок», или брахиданио-рерио — вид пресноводных рыб семейства карповых. Популярная аквариумная рыбка. Является модельным организмом в биологии развития и известна в англоязычной литературе как zebrafish. Данио-рерио является первым домашним животным, генетически модифицированным генами биолюминесценции в 2003 году.

Внешний вид

Данио-рерио

Данио-рерио

Научная классификация

Царство: Животные Тип: Хордовые Класс: Костные рыбы Отряд: Карпообразные Семейство: Карповые Род: Данио Вид: Данио-рерио

Латинское название

Danio rerio

Систематика на Викивидах Изображения на Викискладе ITIS 163699 N

Как объект биологии развития D. rerio имеет некоторые преимущества над другими позвоночными. Эмбрион развивается быстро, и проходит стадии от яйца до личинки всего за три дня. Эмбрионы крупные, выносливые, крепкие, прозрачные и развиваются вне матери, что облегчает манипуляции с ними и наблюдение.

Для выключения генов или изменения сплайсинга в Danio rerio часто используют технологию антисмысловых Морфолино. Такие олигонуклеотиды являются синтетическими макромолекулами, содержащими ДНК- или РНК-нуклеотиды, которые связываются с комплементарными последовательностями РНК и снижают активность генов. Олигонуклеотиды Морфолино могут быть введены в клетки зародыша после стадии 32 клеток, при этом образуется организм, в котором активность генов снижена только в тех клетках, которые происходят от модифицированной клетки. Хотя клетки раннего зародыша непроницаемы для крупных молекул, они позволяют проникать молекулам Морфолино между клетками.

:::::::::::::::::::

ДНК-метилтрансфераза

ДНК-метилтрансферазной активностью обладают несколько групп ферментов:

• 
  цитозин-ДНК-метилтрансферазы — ферменты, ответственные за поддержание картины метилирования генома клетки;
  
• 
  ферменты системы рестрикции-модификации, проявляющие КФ 2.1.1.72-ДНК-метилтрансферазная) и КФ 2.1.1.113-ДНК-метилтрансферазная) активности; примерами могут служить ферменты PvuII и TaqI.
  

Цитозин-ДНК-метилтрансферазы катализируют перенос метильной группы от S-аденозил-метионина на остаток цитозина, находящегося в специфической последовательности в двухцепочечной ДНК, с образованием 5-метилцитозина и S-аденозилгомоцистеина. Эта реакция необратима. Сравнение структуры прокариотических и эукариотических ДНК-метилтрансфераз позволяет отнести их к одному классу ферментов. Все эти ферменты представляют собой мономерные белки, содержащие консервативные гомологичные участки, ответственные за ферментативные функции. У большинства цитозин-ДНК-метилтрансфераз насчитывают до 10-ти таких участков. Среди них различают 4 умеренногомологичных мотива, которые могут отсутствовать у некоторых ферментов, и 6 высокогомологичных мотивов. Между участками VIII и IX расположен домен TRD, длина и аминокислотный состав которого вариабельны.

Эукариотические ДНК-метилазы выполняют функцию поддержания метилирования. После репликации ДНК данные ферменты метилируют цитозин по сайтам CpG и CpNpG во вновь синтезированных цепях. ДНК-метилтрансферазы эукариот способны, хотя и с меньшей эффективностью, производить метилирование ДНК de novo.

Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз семейства DNMT1. Полуметилированный дуплекс определяет метилирование цитозина в нижней цепи. Наличие пары *С с гуанином в верхней цепи необязательно. Асимметричный сайт узнавания заключён в рамку

Семейство DNMT1

ДНК-метилтрансфераза семейства DNMT1 мыши представляет собой белок с молекулярной массой 190 кДа, содержащий 1620 аминокислотных остатков. Основная активность этого фермента заключается в метилировании полуметилированных сайтов CpG. Молекула ДНК-метилтрансферазы DNMT1 значительно больше прокариотического фермента за счёт наличия N-концевого регуляторного участка, составляющего ²/₃ от всей длины полипептидной цепи. Именно этот участок отвечает за «предпочтение» ферментом полуметилированных сайтов перед неметилированными. Регуляторный N-концевой участок соединён с каталитическим C-концевым при помощи Gly-Lys-повторов. Считается, что ген dnmt1 образовался путём слияния гена прокариотической ДНК-метилазы с одним или двумя генами ДНК-связывающих белков.

Человеческий фермент DNMT1 принципиально не отличается от мышиного.

Фермент DNMT1 имеет несколько изоформ: соматический DNMT1, промежуточный вариант и изоформа, характерная для ооцитов. DNMT1o синтезируется и накапливается в цитоплазме ооцитов, а затем, во время раннего эмбрионального развития, транспортируется в клеточное ядро.

Фермент может проявлять аномальную метилирующую активность, в частности, метилируя CpG-пары в области петли одноцепочечной ДНК, уже содержащей метилированные сайты CpG.

Инактивация мышиного фермента DNMT1 приводит к значительному уменьшению метилирования генома и к гибели развивающихся эмбрионов на 10-11 день развития. Оставшийся уровень в 30 % и способность стволовых клеток к метилированию ретровирусной ДНК de novo обеспечиваются другими ДНК-метилтрансферазами.

Семейство DNMT2

Семейство DNMT3

DNMT3a активнее метилирует сайты CpG, чем CpA, CpT, и CpC. DNMT3a метилирует сайты CpG намного медленнее, чем DNMT1, но быстрее, чем DNMT3b. Несмотря на то, что функции ферментов DNMT3a и DNMT3b во многом перекрываются, имеются также и различия. Так, DNMT3b отвечает за метилирование сателлитных повторов в области центромерного линкера, а мутация гена dnmt3b у человека приводит к ICF-синдрому. ICF-синдром — это редкое аутосомальное рецессивное генетическое заболевание, которое характеризуется дефектами иммунной системы и нарушением нормального строения лица. Синдром связан с нестабильностью центромерного гетерохроматина. При этом основные компоненты гетерохроматина, сателлитные участки DNA II и DNA III, оказываются недостаточно метилированы.

DNMT3L содержит DNA-метилтрансферазный мотив и является необходимым для эффекта материнского геномного импринтинга, оставаясь при этом каталитически неактивным. DNMT3L экспрессируется при гаметогенезе, когда и происходит геномный импринтинг. Отсутствие DNMT3L ведет к биаллельной экспрессии генов, для которых в норме не характерна экспрессия материнского аллеля. DNMT3L взаимодействует с DNMT3a и DNMT3b в клеточном ядре. Хотя DNMT3L неспособен проводить метилирование, белок может принимать участие в репрессии транскрипции.

У растений обнаружено три семейства ДНК-метилтрансфераз.

Семейство Met1

В это семейство входит и ген NtMETI табака, ген ДНК-метилтрансферазы гороха. Наиболее активны данные ферменты в клетках меристем растений.

Семейство хромометилаз

Хромометилазы характерны только для растений.

Семейство DRM

Другие ДНК-метилтрансферазы растений

Существуют и другие ДНК-метилтрансферазы растений, такие как METIII Arabidopsis thaliana, лишённая N-концевого домена.

Во отличие от животных, инактивация ДНК-метилтрансфераз у растений не ведёт к летальному эффекту, однако также приводит к аномалиям развития.

Бактериальный фермент M. HhaI вместе с узнаваемым участком ДНК. Домен, распознающий мишень фермента образует специфический контакт с краями оснований в большой канавке молекулы ДНК. Большой каталитический домен отвечает за перенос метильной группы от S-аденозил-L-метионина на цитозин. Мишень — цитозин — полностью выворачивается из двойной спирали, глубоко погружаясь в активный центр фермента.

ДНК-метилтрансфераза - ДНК-метилтрансферазы грибов

ДНК-метилтрансферазы Ascobolus

У аскомицета Ascobolus обнаружены 2 гена: MASCI и MASK2. Первый кодирует белок с молекулярной массой 61,5 кДА, состоящий из 537 аминокислотных остатков. Он содержит 10 консервативных мотивов, характерных для цитозин-метилтрасфераз, но отличается более коротким TRD между VIII и IX мотивом и N-концевым доменом, негомологичным таковому у DNMT1. Мутация в гене MASCI не влияет на поддерживающее метилирование ДНК, но нарушает метилирование de novo повторов в ДНК и приводит к стерильности штаммов, гомозиготных по данной мутации. Ген MASK2 Ascobolus принадлежит семейству DNMT1.

Выключение обоих генов не приводит к нарушению поддерживающего метилирования ДНК Ascobolus, что говорит о наличии ещё как минимум одного гена ДНК-метилтрансферазы.

ДНК-метилтрансфераза Neurospora crassa

У Neurospora crassa имеется один ген ДНК-метилтрансферазы — DIM-2. Белок DIM-2 отвечает за метилирование всего генома, его инактивация ведет к полному деметилированию ДНК Neurospora crassa. Белок состоит из 1454 аминокислотных остатков и принадлежит к семейству DNMT1. Нарушения экспрессии DIM-2 не приводят к заметным аномалиям в развитии гриба

:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::

Долговременный эксперимент по эволюции E. coli

уникальный эксперимент по эволюции бактерии E. coli в искусственных условиях, проведённый группой под руководством Ричарда Ленски в университете штата Мичиган. В процессе эксперимента прослежены генетические изменения, происходившие в 12 популяциях E. coli на протяжении 50 000 поколений. Эксперимент начался 24 февраля 1988 года и продолжается более 20 лет.

За время эксперимента обнаружен широкий спектр генетических изменений. Наиболее поразительной адаптацией стала появившаяся у одной из популяций способность усваивать цитрат натрия.

Цель эксперимента

Целью эксперимента был поиск ответа на некоторые важные вопросы эволюционной биологии:

• 
  Каким образом меняется во времени скорость эволюционных изменений;
  
• 
  Какова повторяемость эволюционных изменений для различных популяций, существующих в одинаковой среде;
  
• 
  Каково соотношение эволюции на генотипическом и фенотипическом уровнях.
  

12 участвующих в эксперименте популяций E. coli на 25 июня 2008 года

Бактерии E. coli. Снимок сканирующим электронным микроскопом

Выбор бактерии E. coli объясняется быстрой сменой поколений у этого организма и небольшим размером генома, что позволяет за короткий период времени исследовать процессы, которые у более сложных организмов занимают тысячелетия. Благодаря тому, что эта бактерия десятилетиями используется в молекулярной биологии, она хорошо исследована, технологии работы с ней хорошо отлажены. Бактерия без потери жизнеспособности может длительно сохраняться в замороженном состоянии, что позволяет вести своеобразную «летопись эксперимента», а размораживание нужного поколения позволит при необходимости повторить эксперимент с любой ранее сохранённой точки.

В качестве предкового штамма E. coli был взят «штамм Bc251», описанный в 1966 году Сеймуром Ледербергом русск. и использованный Брюсом Левиным русск. в экспериментах по бактериологической экологии в 1972 году. Характерными чертами этого штамма были T6, Str, rm, Ara. Перед началом эксперимента путём точечной мутации оперона ara Ленски подготовил Ara вариант этого штамма, способный усваивать арабинозу.

В начале эксперимента были созданы 12 популяций исходного штамма. Для точной идентификации каждой популяции были задействованы генетические маркеры. Каждая популяция размножалась в искусственной среде, где скорость размножения ограничивалась стрессовыми условиями. Каждый день 0,1 мл содержимого каждой пробирки переносилось в пробирку с 10 мл свежей питательной среды, где размножение бактерий продолжалось. Каждое 500-е поколение замораживалось в глицерине при температуре -80 °С, чтобы в будущем с появлением новых методов анализа имелась возможность провести более подробное исследование. По ходу эксперимента полностью секвенировался геном предкового штамма, а также геномы некоторых этапных поколений.

Поскольку размер генома E. coli составляет 4,6 млн нуклеотидных пар, то при наблюдаемой скорости мутаций, каждая пара нуклеотидов в геноме за 20 лет заменяется в среднем более одного раза. Не все мутации, возникающие в геноме, равнозначны. Полезность мутации определяется скоростью размножения их носителей. Повышенная скорость размножения позволяет мутировавшей бактерии вытеснять из популяции бактерии с отсутствующей мутацией. При этом мутация «фиксируется» и присутствует в геноме всех последующих поколений. Вредные мутации действуют противоположным образом. Существуют также «нейтральные» мутации, которые не влияют на скорость размножения бактерий, так как возникают в незначимых участках генома. Эти мутации не фиксируются и не подавляются отбором и, таким образом, появляются и исчезают случайным образом.

В эксперименте использовалась линия E. coli, размножающаяся исключительно делением. Таким образом, круг исследуемых явлений ограничивался вновь возникшими мутациями.

Питательная среда DM25

В эксперименте использовалась минимальная питательная среда Дэвиса с концентрацией глюкозы 25 мг/л, обозначаемая как DM25. Эта среда обеспечивает в стационарной фазе плотность 50 млн бактерий/мл.

Объём культуры составлял 10 мл. Культуры содержались в 50-мл конических колбах, свободно накрытых перевёрнутыми стеклянными стаканами. Инкубация происходила при температуре 37 °С и скорости вращения 120 об/мин. По прошествии суток 0,1 мл культуры переносился в колбу с 9,9 мл свежей среды.

Состав среды DM25 следующий:

Компонент	Формула	Объём	Масса	Приготовление
Гидрофосфат калия	K2HPO4 · 3H2O		3,5 г	Приготовить раствор и автоклавировать
Дигидрофосфат калия	KH2PO4 · H2O		1,0 г
Сульфат аммония	2SO4		0,5 г
Цитрат натрия	Na3C6H5O7		0,25 г
Вода	H2O	500 мл
Глюкоза	C6H12O6	0,125 мл	12,5 мг	После автоклавирования добавить из стерильных флаконов
Сульфат магния	MgSO4	0,5 мл	25 мг
Тиамин	C12H17N4OS	0,5 мл	25 мг

Следует отметить, что обычно бактерии E. coli не потребляют цитрат натрия, он используется только как хелатор железа.

Частота мутаций

Изменение числа фиксированных мутаций и скорости роста бактерий от поколения к поколению

В работе приводятся результаты исследования популяции A-1, одной из 12, участвовавших в эксперименте. Авторы разделяют эволюцию популяции на два этапа, граница между которыми примерно приходится на поколение 26 000.

При секвенировании генома поколения 20 000 и сравнении его с геномом исходного штамма были обнаружены 45 фиксированных мутаций разного типа, из которых основная масса пришлась на однонуклеотидные замены. Скорость накопления фиксированных мутаций в течение первого этапа эксперимента оставалась примерно постоянной. Неожиданным оказалось то, что приспособленность бактерий к среде, выражавшаяся в скорости размножения, до поколения 1500 росла очень быстро, затем её рост замедлился при прежней скорости фиксирования мутаций.

В других популяциях за первые 20 000 поколений менее 100 фиксированных мутаций, из которых полезными были только от 10 до 20.

Картина эволюционных изменений в популяции А-1 кардинально изменилась после поколения 26 000. В этот момент произошла мутация в гене mutT, который кодирует белок, участвующий в репарации ДНК. В результате этого среднее число фиксированных мутаций резко возросло до 0,05 за поколение. Всего в поколениях 20 000—40 000 зафиксировалось 609 мутаций. Аналогичное увеличение скорости мутагенеза наблюдалось в трёх других популяциях из 12.

Изменения в метаболизме

Популяция A-3, заметно более мутная из-за повышенной плотности бактерий

Неожиданным оказался результат эволюции популяции А-3. В момент, соответствующий поколению 33 127, в колбе было замечено сильное помутнение, свидетельствующее о высокой плотности бактерий. Подобный эффект обычно наблюдался при загрязнении культуры бактериями другого вида, потребляющими цитрат натрия. Поскольку концентрация цитрата натрия в среде в 20 раз превышает концентрацию глюкозы, потребление цитрата обеспечивает значительно более высокую плотность клеток.

Неспособность питаться цитратами является характерной особенностью E. coli, поскольку каналы в её мембране не пропускают молекулы цитратов. Тем не менее, исследование показало, что цитрат натрия потребляют именно мутантные бактерии E. coli. Проверка генетических маркеров, а также наличие мутаций pykF и nadR, характерных для предыдущих поколений А-3, подтвердили, что бактерии Cit не привнесены извне, а являются мутировавшими особями исходного штамма.

Ретроспективное обследование замороженных образцов показало, что в поколении 31 000 бактерий Cit нет вообще, в поколении 31 500 они составляют 0,5 %, в поколениях 32 000 и 32 500 — 15 и 19 % соответственно. В поколении 33 000 Cit практически исчезают, однако в поколении 33 500 так же неожиданно отвоёвывают жизненное пространство и последующих поколениях полностью доминируют. Исследователи объясняют это появлением между поколениями 33 000 и 33 500 некоторой пока не установленной мутации, которая в сочетании со способностью питаться цитратом обеспечило бактериям Cit эволюционное преимущество.

Была проверена гипотеза о том, что способность усваивать цитрат имелась у бактерий изначально, однако до возникновения сопутствующих мутаций это качество явно не проявлялось. Гипотеза не подтвердилась, так как бактерии до 31 000-го поколения оказались неспособны размножаться в среде без глюкозы.

:::::::::::::::::::::::::::::

Зимография

электрофоретическая технология, основанная на SDS-PAGE, которая включает субстратную сополимеризацию с полиакриламидным гелем, для обнаружения ферментативной активности. Образцы готовят в стандартно обработанном SDS-PAGE буфере, но без кипячения и без редуцирующего агента. После электрофореза, SDS удаляется из геля выдерживанием в небуферезированном Тритон X-100, затем следует выдерживание в подходящем расщепляющем буфере, за оптимальный отрезок времени при 37 °C. Далее, зимограмма окрашивается, при этом, в том месте, где субстрат был расщеплён ферментом, проявляются области расщепления в виде отчётливых полосок на тёмно окрашенном фоне. Эти протоколы, однако, нуждаются в сильных уточнениях. Например, пищеварительная гликозидаза D. melanogaster выживает в редуцированных условиях и при объёмном подогреве.

Действительно, разделение дальнейшим нагреванием до 50 °C приводит к явному увеличению разрешения полос, без существенных потерь активностей.

Plasmodium knowlesi Отпечаток гемоглобиназы.

Желатин — это наиболее стандартный из используемых субстратов и может быть полезен для демонстрации активности желатин разрушающих протеаз, но зимография может быть применена и к широкому кругу ферментов, включающему ксилоназы, протеазы, липазы, хитаназы, и т. д.

Общий протокол, используемый в прошлом для зимографии альфа-амилазной активностей, был назван протоколом тонкого слоя крахмала W. W. Doane. По этому протоколу исходный PAGE гель запускался для разделения белков в гомогенате. После этого тонкий гель с с растворённым в нём крахмалом покрывался сверху исходным гелем на некоторое время. Крахмал окрашивался раствором Люголя.

Обратная зимография сополимеризует как субстрат, так и фермент с акриламидом, и это полезно для демонстрации активности ингибитора фермента. При последующем окрашивании, участки ингибирования визуализируются как тёмные пятна на чистом.

::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::

Изотахофорез — метод разделения различных типов ионов по их подвижности в электрическом поле. При ИТФ все виды ионов мигрируют в одном направлении, образуя набор зон, находящихся в равновесном состоянии и перемещающимися с одинаковыми скоростями.

Теоретические основы метода

В основе метода ИТФ лежит система, состоящая из трех различных электролитов, объединенных общим противоионом:

• 
  ведущий электролит, содержащий анионы с наиболее высокой электрофоретической подвижностью, располагается в анодной области;
  
• 
  замыкающий электролит, содержащий анионы с минимальной подвижностью, располагается в катодной области;
  
• 
  смесь электролитов анализируемой смеси, содержащая анионы с промежуточной подвижностью.
  

Если через эту систему пропустить электрический ток, то анионы расположатся последовательно в соответствии с их электрофоретической подвижностью, ведущий в области анода, замыкающий в области катода, остальные между ними в виде узких зон с четкими концентрационными границами. Ширина отдельных зон по завершении процесса соответствует абсолютному количеству в смеси того или иного аниона.

Поскольку отдельные зоны располагаются последовательно. они практически соприкасаются, поэтому в исследуемый образец вносят буфер, содержащий анион с промежуточной подвижностью, зона которого встроится в полученную последовательность и раздвинет зоны исследуемых анионов. Эти вспомогательные зоны называются спейсерами — разделителями, функции которых выполняют амфолиты-носители, используемые в методе ИЭФ. особенностью метода ИТФ является то, что процесс сопровождается концентрированием зон, эффект от которого приводит к разрешению, сравнимому и даже превосходящему разделение методом ИЭФ. Результаты разделения смесей методом ИТФ фиксируются на ленте самописца в виде графика измерения трех параметров:

• 
  интегральная кривая тепловыделения: по этой кривой можно определить разницу температур между соседними зонами, что служит мерой градиента напряженности поля, то есть разницы электрофоретических подвижностью двух ионов
  
• 
  дифференциальная кривая тепловыделения: длина отрезков этой кривой соответствуют ширине зоны вещества, а также служит мерой абсолютного количества вещества в пробе
  
• 
  кривая поглощения в УФ-свете: длина отрезков этой кривой соответствует значению экстинкции вещества. Зная коэффициент молярной экстинкции вещества, можно определить абсолютное содержание вещества в пробе, а также вычислить его концентрацию в зоне.
  

Этапы разделения двух образцов при помощи изотахофореза:

Белый цвет — ведущий электролит, серый — замыкающий электролит, заштрихованы — анализируемые образцы

Изотахофорез - Приборы для изотахофореза

Аналитический изотахофорез проводят в капиллярном приборе для изотахофореза, в тефлоновом капилляре с внутренним диаметром 0,5 мм.

Препаративный изотахофорез проводят в колонке с полиакриламидным гелем.

Применение изотахофореза

1. 
   Аналитическое разделение пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов с высоким разрешением.
   
2. 
   Препаративное разделение белков.
   
3. 
   Накопление в виде узкой зоны следовых количеств веществ из больших объемов пробы вследствие эффекта концентрирования.
   
4. 
   Определение электрофоретической подвижности.
   

::::::::::::::::::

Изоэлектрическое фокусирование

технология разделения молекул по разнице в их электрических зарядах. Это разновидность зонального электрофореза, которую обычно производят в геле. Белок, который находится в рН-зоне ниже собственной изоэлектрической точки, будет положительно заряжен и будет перемещаться к катоду. В результате перемещения заряд молекулы будет снижаться, а перемещение — замедляться. В результате белки образуют четкие полосы, и каждый белок будет располагаться в градиенте значений рН в соответствии с изоэлетрической точкой. Данная технология дает возможность очень четкого разделения белков, отличающихся по заряду.

Применение

Метод применяют для изучения белков, которые отличаются значениями изоэлектрической точки, то есть соотношением остатков кислых и основных аминокислот. Белки наносят на иммобилизованный градиент рН полиакриламидного или агарозного геля. Изоэлектрическое фокусирование позволяет разделить белки, отличающиеся по изоэлектрическим точкам менее, чем на 0,01. Изоэлектрическое фокусирования является первым этапом в проведении двухмерного электрофореза, при котором белки сначала разделяют по изоэлектрическим точкам, и далее — по молекулярной массе с помощью электрофореза в акриламидном геле.

:::::::::::::::::::::::::::

Иммуноферментный анализ — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Сущность и классификация ИФА

Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

Возможна классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа. Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания, то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог, конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.

Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Ферментативная реакция проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.

«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

1. 
   Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченыйантиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом.
   К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.
   Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.
   
2. 
   В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
   Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.
   Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.
   

Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества - суперантигены - неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям. Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции.

Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов

В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяются на:

1. 
   Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов;
   
2. 
   Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;
   
3. 
   Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.
   

Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.

Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена.

Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными и высоко специфичными.

Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности.

На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.

:::::::::::::::::::::::::

Иммунохроматографический анализ

иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест полосок, панелей или тест кассет.

Сущность метода

Принцип действия состоит в том, что при погружении тест полоски в биологическую жидкость, она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом.

Различают 2 формата ИХА: прямой и конкурентный метод.

1. В схеме прямого ИХА используется конъюгат антитела-метка, нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии – антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с конъюгатом, происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.

Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов, возбудителей инфекционных заболеваний.

2. Метод конкурентого ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где на иммобилизован конъгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста. При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг:белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий является отрицательным результатом анализа.

Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.

Преимуществом метода является быстрота его и легкость его применения, возможность использования неприборных форматов ИХА с визуальной оценкой результата анализа. В этом случае не требуется использование никакого оборудования и анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в т.ч. "полевых". Существуют также приборные полуколичественные и количественные форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски

:::::::::::::::::

Интеркаляция ДНК

Молекула бромистого этидия интеркалирует между адениловыми основаниями ДНК дуплекса

Существует несколько способов, которыми молекулы могут взаимодействовать с ДНК. Лиганды могут ковалентно, электростатически связываться либо интеркалировать. Интеркаляция возможна в случае, если лиганд имеет подходящие размеры и химическую природу и может поместиться между основаниями ДНК. Такие лиганды обычно имеют полициклическую, ароматическую структуру, являются плоскими.

ДНК интеркаляторы используются при химиотерапии как средства, ингибирующие репликацию ДНК в быстрорастущих раковых клетках, например, доксорубицин и даунорубицин, и дактиномицин.

В молекулярной биологии интеркалирующие агенты, такие как бромистый этидий, используются для флуоресцентной маркировки ДНК, например при электрофорезе ДНК в агарозном геле.

:::::::::::::::::::::::

Клеточный экстракт

Экстракт — разрушенные механическим или химическим способом клетки, использующиеся для воспроизведения биохимических процессов «в пробирке». Для получения экстрактов используются клетки определённого типа, чаще всего, клетки проростков пшеницы или ретикулоцитов кролика. Проведение экспериментов в клеточных экстрактах позволяет контролировать влияние отдельных компонентов на протекание таких сложных процессов как репликация ДНК и транскрипция. При последующем фракционировании экстрактов могут выделятся большие количества отдельных белков, например, факторов инициации трансляции.

История

В конце XIX века химическое сообщество не имело единого мнения по вопросу о том, необходимы ли для сбраживания сахаров живые клетки или каталитические процессы происходят на уровне отдельных молекул. В 1897 году немецкие химики-братья Ганс и Эдуард Бюхнер показали, что бесклеточный экстракт дрожжей катализирует ферментацию

ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ

Клонирование, в биологии — метод получения нескольких генетически идентичных организмов путем бесполого размножения.

Долли— самка овцы, первое млекопитающее, успешно клонированное из клетки другого взрослого существа.

Основные сведения

Термин клонирование пришёл в русский язык из английского.

Первоначально слово клон стали употреблять для группы растений, полученных от одного растения-производителя вегетативным способом. Эти растения-потомки в точности повторяли качества своего прародителя и служили основанием для выведения нового сорта. Позже клоном стали называть не только всю такую группу, но и каждое отдельное растение в ней, а получение таких потомков — клонированием.

Со временем значение термина расширилось и его стали употреблять при выращивании культур бактерий.

Успехи биологии показали, что и у растений, и у бактерий сходство потомков с организмом-производителем обусловливается генетической идентичностью всех членов клона. Тогда уже термин клонирование стали употреблять для обозначения производства любых линий организмов, идентичных данному и являющихся его потомками.

Позже название клонирование было перенесено и на саму технологию получения идентичных организмов, известную как замещение ядра, а потом также и на все организмы, полученные по такой технологии, от первых головастиков до овцы Долли.

И уже в конце 1990-х годов XX века, подразумевая возможность применения той же технологии для получения генетически идентичных человеческих индивидов, заговорили и о клонировании человека. Термин перестал быть достоянием научной общественности, его подхватили СМИ, киноискусство, литература, производители компьютерных игр, и он вошёл в язык как общеупотребительное слово, уже не имеющее того специального значения, которым он обладал около ста лет назад.

Для бактерий клонирование является единственным способом размножения. Однако обычно, когда говорят о клонировании бактерий, имеют в виду намеренное размножение какой-то бактерии, выращивание её клона, культуры.

Естественное клонирование у сложных организмов

Клонирование широко распространено в природе у различных организмов. У растений естественное клонирование происходит при различных способах вегетативного размножения. У животных клонирование происходит при амейотическом партеногенезе и различных формах полиэмбрионии. Так, среди позвоночных известны клонально размножающиеся виды ящериц, состоящие из одних партеногенетических самок. У человека естественные клоны — монозиготные близнецы. У некоторых видов броненосцев в норме рождается от четырёх до девяти монозиготных близнецов. Широко распространено клональное размножение среди ракообразных и насекомых. Уникальный вариант естественного клонирования открыт недавно у муравьёв — малого огненного муравья , самцы и самки которого клонируются независимо, так что генофонды двух полов не смешиваются. У этого вида рабочие особи развиваются из оплодотворенных яиц, матки — из неоплодотворенных диплоидных яиц. В некоторых яйцах, оплодотворенных самцами, все хромосомы матери разрушаются, и из таких гаплоидных яиц развиваются самцы

Благодаря фундаментальным биологическим открытиям XIX-го — XX-го веков, а именно: открытию клеточного строения тканей, изобретению электронного микроскопа, открытию структуры клеточного ядра, хромосом, ДНК, генов, — стало возможным то, что ныне носит название молекулярного клонирования. Это технология клонирования наименьших биологических объектов — молекул ДНК, их частей и даже отдельных генов. Для молекулярного клонирования ДНК вводят в вектор. Размножаясь, бактерии и фаги многократно увеличивают и количество введенной ДНК, в точности сохраняя её структуру. Чтобы затем выделить большое количество такой ДНК, необходимо отделить бактерии или фаги, которые её содержат, от всех остальных, для чего и применяют клонирование, то есть выделение и размножение бактериального или фагового клона, содержащего необходимые молекулы ДНК. Для облегчения селекции бактериальных клонов в плазмиды обычно вводят ген резистентности к антибиотику, чаще всего ампициллину, в присутствии которого погибают все бактерии, не имеющие клонируемой плазмиды. Такое клонирование необходимо для изучения биологических молекул, их идентификации, решения вопросов клонирования тканей и др. Наибольшее внимание учёных и общественности привлекает клонирование многоклеточных организмов, которое стало возможным благодаря успехам генной инженерии. Создавая особые условия и вмешиваясь в структуру ядра клетки, специалисты заставляют её развиваться в нужную ткань или даже в целый организм. Допускается принципиальная возможность воспроизведения даже умершего организма, при условии сохранения его генетического материала.

Различают полное и частичное клонирование организмов. При полном воссоздаётся весь организм целиком, при частичном — организм воссоздаётся не полностью.

Репродуктивное клонирование предполагает, что в результате получается целый организм. Кроме научных целей оно может применяться для восстановления исчезнувших видов или сохранения редких видов.

Одно из перспективных применений клонирования тканей — клеточная терапия в медицине. Такие ткани, полученные из стволовых клеток пациента, могли бы компенсировать недостаток и дефекты собственных тканей организма и не отторгаться при трансплантации. Это так называемое терапевтическое клонирование.

Терапевтическое клонирование предполагает, что в результате намеренно не получается целого организма. Его развитие останавливают заранее, а получившиеся эмбриональные стволовые клетки используют для получения нужных тканей или других биологических продуктов. Эксперименты показывают, что терапевтическое клонирование может быть с успехом применено для лечения некоторых заболеваний, считавшихся неизлечимыми.

Клонирование животных и высших растений

В 2007 году Яну Уилмуту, одному из создателей овцы Долли, Королева Великобритании Елизавета II пожаловала рыцарское звание.

Сформировалась новая фобия, случаи которой встречаются в психиатрии. Врач-психиатр Виктор Яровой, в декабре 2008 года определил новое понятие подобным расстройствам — бионализм. Бионализм — страх перед клонированными людьми, перед их возможным превосходством в физическом, моральном и духовном развитии.

жүктеу/скачать 1.06 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: