Методическое пособие к малому практикуму по биохимии и молекулярной биологии
Работа 15. Количественное определение глюкозы
жүктеу/скачать 1.21 Mb. Pdf көрінісі
|
| Работа 15. Количественное определение глюкозы
глюкозооксидазным методом При окислении глюкозы кислородом воздуха под действием глюко- зооксидазы (фермент из плесневых грибов) образуется эквимолярное ко- личество перекиси водорода. Под действием пероксидазы (фермент из корней хрена) перекись водорода окисляет некоторые ароматические ами- ны (ортотолидин, 4-аминоантипирин и др.) в окрашенные продукты. Ин- тенсивность окраски последних пропорциональна концентрации глюкозы и измеряется фотометрически. Метод позволяет определить концентрацию глюкозы в пределах 3–22 мM/л (0,5 – 4 г/л или 50 – 400 мг %). Ход исследования Для проведения исследования необходимы три пробирки (одна из них центрифужная). В первую пробирку (центрифужную) наливают 1,1 мл 0,9 %-ного раствора NaCl (физраствор), затем 0,1 мл исследуемой крови; 0,4 мл 5 %-ного раствора ZnSO 4 ; 0,4 мл 1,2 %-ного раствора NaOH, пере- мешивают. Через 10 мин центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость используют далее в качестве исследуемо- го раствора (опытная проба). Во вторую пробирку наливают 1,9 мл физраствора и 0,1 мл 10 мМ раствора глюкозы, перемешивают. Полученный раствор используют в ка- честве стандартного раствора глюкозы (стандартная проба). В третью пробирку вносят 1,9 мл физраствора и 0,1 мл воды (кон- трольная проба). Затем берут три чистых пробирки и вносят в них реаген- ты по схеме, представленной в таблице. Реагенты Опытная проба (пробирка 1) Станд. проба (пробирка 2) Контрольная проба (пробирка 3) а) Энзимо-хромогенный реактив (содержит глю- козооксидазу, перокси- дазу, о-толидин), мл 3 3 3 б) Исследуемый раствор, мл 1 - - в) Стандартный раствор глюкозы, мл - 1 - г) Физраствор + вода, мл - - 1 При использовании вместо о-толидина других хромогенов условия подготовки крови, инкубации и регистрации результатов изменяются. Пробы тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре. 43 Через 10 мин опытную и стандартную пробы фотометрируют против кон- троля при 625–670 нм (красный светофильтр). Расчет производить по формуле: где С о – концентрация глюкозы в исследуемой крови, мМ/л; Е о - оптическая плотность опытной пробы, ед. опт. плотности; Е к - оптическая плотность стандартной пробы, ед. опт. плотности; С к - концентрация глюкозы в стандартной пробе (10 мМ/л). жүктеу/скачать 1.21 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|