Работа 19. Количественное определение ДНК

49 
фосфорных соединений путем осаждения ее спиртом и промывания осадка 
трихлоруксусной кислотой. Ниже представлена схема выделения.
Ход исследования 
100 мг ткани печени помещают в пробирку с 1 мл раствора NaOH 
(1 Н) и ставят в кипящую водяную баню на 15 мин. Периодически содер-
жимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой. В течение этого 
времени ткань полностью растворяется (получившаяся жидкость пред-
ставляет собой прозрачный или слегка опалесцирующий раствор). Пробу 
охлаждают при комнатной температуре, а затем при 0 ºС (лед). К охла-
жденной пробе добавляют 0,5 мл насыщенного раствора NaCl в 20 %-ном 
растворе СН
3
СООН, при этом белки выпадают в осадок. Через 3

5 мин по-
сле добавления реактива пробу центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин. 
Надосадочную жидкость сливают в находящуюся во льду пробирку, в ко-
торую налито 6 мл С
2
H
5
OH; при этом ДНК выпадает в осадок, а РНК и 
другие фосфорные соединения остаются в спиртовом растворе
. 
Для полного осаждения ДНК содержимое пробирки тщательно пе-
ремешивают и оставляют на холоде в течение 1 ч. Затем содержимое про-
бирок центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин; центрифугат сливают, а 
осадок ДНК промывают 5 мл 5 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты 
путем центрифугирования. Центрифугат сливают, а полученный препарат 
ДНК используют для количественного определения ДНК по фосфору. 
2. О п р е д е л е н и е с о д е р ж а н и я Д Н К в п р е п а р а т е п е ч е ни .
Для построения калибровочного графика, необходимого для анализа 
содержания неорганического фосфора, используют стандартный раствор 
КН
2
РО
4
, содержащий 5 мкг фосфора в 1 мл пробы (22 мг KH
2
PO
4
в 1 л). 
Из стандартного раствора в пробирках готовят серию разведений 
следующим образом: 
№
пробирки 
Объем 
станд. рас-
твора, мл 
Вода, 
мл 
Содержание
фосфора в пробе, 
мкг 
Концентрация 
фосфора, 
мкг/мл 
Оптическая 
плотность 
1 
1 
4 
5 
1 
2 
2 
3 
10 
2 
3 
3 
2 
15 
3 
4 
4 
1 
20 
4 
Из каждой пробирки отбирают 2,5 мл жидкости, прибавляют 0,25 мл 
5 %-ного раствора молибдата аммония и 0,25 мл 1 %-ного раствора гидро-
хинона, перемешивают. Параллельно ставят контроль на реактивы (вместо 
раствора фосфата в реакцию берут 2,5 мл воды). 
Через 5 мин к содержимому пробирки добавляют 1 мл карбонат-

50 
сульфитной смеси и 1 мл воды, перемешивают. Через 10 мин пробы коло-
риметрируют против контроля на реактивы (λ=590

600 нм, оранжевый 
светофильтр, кювета 10 мм) и по полученным данным строят калибровоч-
ную кривую: на оси абсцисс откладывают значения концентраций стан-
дартных растворов, а на оси ординат – соответствующие им оптические 
плотности продуктов реакции. 
Определе ние колич ес тва ДНК в препарате : отмытый три-
хлоруксусной кислотой осадок ДНК количественно переносят в колбy 
Кьельдаля, добавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и 
ставят на газовую горелку. Сжигание (минерализацию) ведут до пол-
ного просветления жидкости. 
После окончания минерализации жидкость из колбы Кьельдаля 
количественно (трижды ополаскивая водой)
переносят в коническую 
колбу, где доводят реакцию среды до нейтральной (по универсальному 
индикатору), добавляя сначала 30 %-ный, а затем 10 %-ный растворы 
NaOH. Далее жидкость количественно переносят в мерную колбу и до-
водят дистиллированной водой до метки 25 мл. После этого содержи-
мое мерной колбы переливают в коническую колбу и перемешивают. Из 
колбы отбирают 2,5 мл жидкости, переносят в пробирку, добавляют 
0,25 мл 5 %-ного раствора молибдата аммония и 0,25 мл 1 %-ного ра-
створа гидрохинона, перемешивают. Через 5 мин к содержимому пробирки 
добавляют 1 мл карбонат-сульфитной смеси и 1 мл воды, перемешивают. 
Через 10 мин определяют оптическую плотность окрашенного раствора на 
ФЭКе. По величине оптической плотности рассчитывают количество фос-
фора в мг на мл пробы, используя калибровочную кривую. Расчет кон-
центрации ДНК в растворе производят, исходя из того, что фосфор со-
ставляет примерно 10 % от массы ДНК. Затем определяют содержание 
ДНК в 100 г ткани печени. 

жүктеу/скачать 1.21 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: