Методическое пособие к малому практикуму по биохимии и молекулярной биологии
Работа 20. Количественное определение ДНК
жүктеу/скачать 1.21 Mb. Pdf көрінісі
|
| Работа 20. Количественное определение ДНК
методом Дише Метод основан на определении углеводного компонента в составе ДНК. Дезоксирибоза в присутствии концентрированных кислот образует фурфуриловый спирт, который конденсируется с дифениламином и дает продукт синего цвета. Для количественного определения пентозы необхо- димо построение калибровочного графика. 1. В ы д е л е н и е Д Н - п р о т е и д а и з с е л е з е н к и к р ы с ы : дезокси- рибонуклеотиды (ДН-протеины) выделяют из тканей, богатых клеточными ядрами: зобной железы, селезенки и др. ДН-протеины растворяются в рас- творах солей средней концентрации, например в 1 M растворе NaCl. При сильном разведении раствора они осаждаются в виде нитей. 51 Ход исследования Берут 0,5–1 г селезенки и растирают в течение 10–15 мин в ступке с окисью алюминия (100 мг), приливая небольшими порциями 8 мл 5 %-ного раствора NaCl, содержащего цитрат натрия. Полученный вязкий раствор переносят в центрифужную пробирку, уравновешивают ее на центрифуж- ных весах и центрифугируют 10–15 мин при 5000 об/мин. Надосадочная жидкость содержит ДН-протеины. В химический стакан наливают 50–80 мл дистиллированной воды и медленно сливают в нее надосадочную жидкость, перемешивая содержи- мое деревянной палочкой. ДН-протеид не растворим в воде, поэтому вы- падает в осадок и наматывается в виде нитей на деревянную палочку. ДН-протеины вместе с палочкой переносят в пробирку. Для раство- рения нитей в пробирку добавляют 8 мл 0,4 %-ного раствора NaOH и пе- ремешивают. Полученный щелочной раствор ДН-протеида делят на две равные части. В одной из них определяют содержание ДНК методом Ди- ше. Вторую часть сохраняют для следующей работы (определение ДНК спектрофотометрическим методом). 2. О п р е д е л е н и е с о д е р ж а н и я Д Н К в п р е п а р а т е . При построении калибровочного графика в качестве стандарта ис- пользуют раствор очищенного препарата ДНК в 0,05 H растворе NaOH (800 мкг/мл). Для приготовления рабочего раствора смешивают равные объемы (по 2 мл) стандартного раствора и 10 %-ного раствора HClO 4 , нагревают смесь в пробирке с обратным холодильником при 100 0 С в течение 15 мин. Затем из этого раствора (концентрация ДНК 400 мкг/мл) готовят серию разведе- ний следующим образом: №№ пробирок Рабочий раствор, мл 5 %-ный раствор HClO 4 , мл Концентрация ДНК, мкг/мл Реактив Дише, мл Оптическая плотность 1 0,5 0,5 300 4 2 1,0 1,0 200 4 3 0,5 1,5 100 4 4 0,3 1,7 60 4 5 (контроль) - 2,0 - 4 Во все пробирки наливают по 4 мл реактива Дише (раствор дифе- ниламина в ледяной уксусной кислоте). Растворы перемешивают, пробир- ки закрывают пробками с обратным холодильником или фольгой и поме- щают в кипящую водяную баню на 10 мин. После охлаждения колоримет- рируют при 595 нм (красный светофильтр) против контроля (5 %-ного рас- твора HСlO 4 – 2 мл + 4 мл реактива Дише). Полученные результаты ис- 52 пользуют для построения калибровочной кривой: значение концентрации ДНК калибровочных растворов откладывают на оси абсцисс, а на оси ор- динат – соответствующие оптические плотности. Определение ДНК в препарате: в пробирку вносят пипеткой 2 мл ис- следуемого раствора (щелочной раствор ДНК из селезенки) и приливают к нему 4 мл реактива Дише. Растворы перемешивают, закрыв пробкой, и по- мещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробирки охлаждают и колориметрируют окрашенные в сине-фиолетовый цвет растворы при 595 нм (красный светофильтр) в кюветах с толщиной светопоглощающего слоя 10 мм против контроля на реактивы. Содержание ДНК определяют по калибровочному графику. Затем производят расчет содержания ДНК в 100 г ткани селезенки. жүктеу/скачать 1.21 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|