Методическое пособие к малому практикуму по биохимии и молекулярной биологии
Работа 21. Спектрофотометрическое определение
жүктеу/скачать 1.21 Mb. Pdf көрінісі
|
| Работа 21. Спектрофотометрическое определение
суммарного содержания нуклеиновых кислот по А.С. Спирину В основе метода лежит характерное свойство азотистых оснований, являющихся производными гетероциклических соединений – пурина или пиримидина, интенсивно поглощать УФ-свет. Нуклеиновые кислоты экстрагируют из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экс- трактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм. Расчет содержания нуклеиновых кислот производится по формуле, предложенной А.С. Спириным. Ход исследования В работе используется ДН-протеид, выделенный из селезенки (ще- лочной раствор, см. работу №8). К 0,4 мл раствора, содержащего ДНК, прибавляют 1,6 мл дистилли- рованной воды и 2 мл 10 %-ного раствора HClO 4 . Содержимое пробирки тщательно перемешивают, затем ее закрывают пробкой с обратным холо- дильником, нагревают в кипящей водяной бане в течение 30 мин. Эта про- цедура обеспечивает количественную экстракцию нуклеиновых кислот из исследуемого материала и их кислотный гидролиз до растворимых фраг- ментов. Гидролизат охлаждают, отфильтровывают 1 мл в градуированную пробирку, добавляют 5 %-ный раствор HClO 4 до 10 мл, перемешивают и определяют оптическую плотность при 270 нм и 290 нм против контроль- ного раствора – 0,5 Н HClO 4 на спектрофотометре (Е 270 и Е 290 соответ- ственно). Содержание нуклеиновых кислот (в мкг/мл) рассчитывают по формуле: (Е 270 Е 290 ) 10,3 С = 2 , 0,19 53 где 0,19 – коэффициент, соответствующий содержанию 1 мкг фосфора нуклеиновых кислот, содержащегося в 1 мл раствора; 10,3 – средний пере- счетный коэффициент, выведенный на основании теоретического расчета содержания фосфора в нуклеиновой кислоте. жүктеу/скачать 1.21 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|