Методическое пособие к малому практикуму по биохимии и молекулярной биологии
жүктеу/скачать 1.21 Mb. Pdf көрінісі
|
| Работа 2. Разделение аминокислот
хроматографическим методом Для разделения и количественного определения аминокислот широ- ко используются различные виды хроматографии. Наиболее доступным из них является метод распределительной хроматографии на бумаге, который основан на различной растворимости аминокислот в двух несмешиваю- щихся жидкостях (органическом растворителе и воде). В качестве инертного носителя используют специальную фильтро- вальную бумагу. Вода, будучи полярным веществом, прочно сорбируется на целлюлозе и служит неподвижной фазой. Подвижной фазой обычно является бутанол (или другой малополярный растворитель). Гидрофобные аминокислоты, лучше растворяющиеся в неполярном растворителе, дви- жутся от точки старта с большей скоростью, чем гидрофильные амино- кислоты. В результате смесь аминокислот разделяется на отдельные ком- поненты, которые обнаруживают с помощью нингидриновой реакции и идентифицируют с применением аминокислот – «свидетелей». Скорость перемещения отдельных аминокислот определяется по- средством коэффициента распределения (R f ): Коэффициент распределения является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, сорт бумаги, температура и др.). Ход исследования Работать осторожно, не прикасаясь руками к центру диска! Бумажный диск диаметром 12 см делят графитовым карандашом на 4 сектора. В центре диска делают небольшой вырез (около 1 см в диамет- ре) и в каждом секторе на линии старта отмечают точку старта. В вырез диска помещают ножку высотой 2 см, сделанную из фильтровальной бума- ги в виде трубочки. Затем в первый сектор в точку старта пастеровской пипеткой наносят 2 капли (дробно!) раствора лизина, во второй 2 капли раствора лейцина, в третий 2 капли раствора тирозина, а в четвертый – смесь двух аминокислот. В чашку Петри наливают 15 мл органического растворителя (бутанол, насыщенный водой). Бумажный диск с нанесенны- ми аминокислотами подсушивают на воздухе и накладывают на края чаш- ки Петри так, чтобы ножка касалась растворителя. Чашку Петри накрыва- ют крышкой и оставляют стоять при комнатной температуре на 30 40 мин, наблюдая за движением фронта растворителя. Разгон заканчивают, как только растворитель пройдет расстояние, равное радиусу крышки чашки Петри. Хроматографический диск вынимают пинцетом из камеры-чашки, Путь, пройденный аминокислотой (до середины пятна) . Путь, пройденный растворителем (до фронта растворителя) R f = 12 отмечают фронт растворителя карандашом и переносят под тягу для испа- рения органического растворителя. Хроматограмму проявляют, смочив ее в 0,5 %-ном растворе нингидрина в ацетоне, подсушивают под тягой и по- мещают в термостат при температуре 50 100 ºС на 5 мин. Для каждой аминокислоты определить R f . Сравнивая положение на хроматограмме аминокислот смеси с положением аминокислот - «свидетелей», определить состав смеси. Полученные данные занести в тетрадь, хроматограммы с указанием идентифицированных аминокислот зарисовать или подклеить в тетрадь. жүктеу/скачать 1.21 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|