Работа 4. Определение изоэлектрической точки белка

15 
белка используется для экспериментального определения его ИЭТ. 
Ход исследования 
В четыре пронумерованные пробирки наливают из бюреток по 2 мл 
буферного раствора с разными значениями рН (3,0; 4,0; 5,0; 6,0) и по 2 мл 
раствора желатины. Содержимое пробирок перемешивают, не допуская 
образования пены, затем в каждую пробирку осторожно, не перемешивая, 
наслаивают по 1 мл спирта. Через 30 мин отмечают пробирку, в которой 
наблюдается наиболее интенсивное (за счѐт выпадения осадка белка) по-
мутнение на границе раздела жидкостей. рН раствора в этой пробирке со-
ответствует ИЭТ данного белка. 
Степень помутнения обозначают так: ( – ) – отсутствие помутнения; 
(+) – слабое помутнение; (++) – выраженное помутнение; (+++) – макси-
мальное помутнение. Результаты эксперимента занести в таблицу. 
№ 
пробирки 
рН буферного
раствора 
Степень помутнения на границе 
раздела сред 
1. 
и так далее 
На основании полученных результатов сделать вывод о значении 
изоэлектрической точки и об особенностях аминокислотного состава дан-
ного белка. 
Работа 5. Количественное определение белка по Горналу
Определение содержания белка является одной из наиболее важных 
и часто используемых методик в научно-исследовательских и клинических 
лабораториях, в производственных условиях. 
Для количественного определения белков применяют физические, 
химические и биологические методы. Наиболее разнообразны химические 
методы, в частности колориметрические. Они основаны на измерении ин-
тенсивности окраски, развивающейся при взаимодействии белков со спе-
цифическими реагентами (см. работу 1 «Сравнение строения и аминокис-
лотного состава различных белков с помощью цветных реакций»). Чтобы 
по интенсивности окраски рассчитать концентрацию белка, строят калиб-
ровочный график. 
Из колориметрических методов определения белка особого внима-
ния заслуживают методы, основанные на биуретовой реакции. Они высоко 
специфичны, точны и легко выполнимы, не требуют дефицитных реакти-
вов, хотя чувствительность их невысокая.
В лабораторной практике широко используется метод Горнала, ос-
нованный на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пеп-

16 
тидных связей белка с ионами двухвалентной меди в щелочной среде. Ин-
тенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации бел-
ка в растворе. Метод Горнала позволяет определить концентрацию белка в 
растворе в пределах 1 – 10 мг/мл. При концентрации белка в исследуемом 
растворе выше 10 мг/мл его необходимо развести водой. 
Ход исследования 
 Для построения калибровочного графика используют стандартный 
раствор альбумина (С = 20 мг/мл), из которого готовят рабочие растворы 
белка различной концентрации в соответствии с таблицей на стр. 16. 
Затем берут 5 пронумерованных пробирок и наливают в них по 1 мл 
раствора белка различной концентрации из соответствующих пробирок с 
рабочими растворами (от 2,0 до 10,0 мг/мл). Добавляют в каждую пробир-
ку по 4 мл биуретового реактива, осторожно перемешивают. В 6-ю про-
бирку наливают 1 мл воды и 4 мл биуретового реактива (контроль на реак-
тивы). Растворы белка перемешивать осторожно, избегая образования пе-
ны! Через 30 мин окрашенные растворы фотометрируют на ФЭКе с зеле-
ным светофильтром (540

550 нм) в кюветах с толщиной светопоглощаю-
щего слоя 10 мм против контрольного раствора. Правила работы на ФЭКе 
см. в приложении 2. 
№№
пробирок 
Стандартный 
раствор белка, 
мл 
Вода, 
мл 
Содержание 
белка в пробе, 
мг 
Концентра-
ция белка, 
мг/мл 
Оптическая 
плотность 
раствора 
1 
0,5 
4,5 
10 
2,0 
2 
1,0 
4,0 
20 
4,0 
3 
1,5 
3,5 
30 
6,0 
4 
2,0 
3,0 
40 
8,0 
5 
2,5 
2,5 
50 
10,0 
Полученные значения экстинкции (оптической плотности раствора) 
используют для построения калибровочного графика.
Для этого на ось х наносят значения использованных концентраций 
белка (С) с 2,0

10,0 мг/мл, на ось y – соответствующие им значения экс-
тинкции (Е). График представляет собой прямую, проходящую через нача-
ло координат. При больших концентрациях белка линейная зависимость 
нарушается, на графике появляется изгиб. Калибровочный график строит-
ся заново при работе с другим прибором или другими реактивами. 
Определение белка в исследуемом растворе: в шестую и седьмую 
пронумерованные пробирки вносят соответственно 1 мл дистиллирован-
ной воды (контроль на реактивы) и 1 мл исследуемого раствора (содержа-
щего от 1 до 10 мг белка), добавляют в обе по 4 мл биуретового реактива, 
осторожно перемешивают. Через 30 мин фотометрируют при зелѐном све-

17 
тофильтре с той же длиной волны в кюветах с толщиной светопоглощаю-
щего слоя 10 мм против контроля. Концентрацию белка в растворе опреде-
ляют по калибровочному графику. При определении белка в сыворотке 
крови (6

8 % белка) ее необходимо развести, учитывая чувствительность 
метода, как минимум в 10 раз. 

жүктеу/скачать 1.21 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: