Методическое пособие к малому практикуму по биохимии и молекулярной биологии
Правила работы на фотоэлектроколориметре (
жүктеу/скачать 1.21 Mb. Pdf көрінісі
|
| Правила работы на фотоэлектроколориметре (ФЭК)
Общие замечания. Определение концентрации веществ в растворе с помощью фотометрических приборов основано на способности растворов поглощать часть свето- вой энергии при прохождении через них пучка света. Явление поглощения света рас- твором количественно описывает закон Ламберта–Бера, согласно которому lg J Jo = ε·C·L, где Jo – начальная интенсивность света, прошедшего через раствор; J – интенсивность света; ε – молярный коэффициент экстинкции, зависящий от природы вещества, по- глощающего свет, и длины волны поглощаемого света; С – концентрация растворенно- го вещества, моль/л; L – толщина слоя раствора, см. Величина, стоящая в левой части уравнения, характеризует степень ослабления интенсивности света при прохождении его через раствор. Эту величину называют оп- тической плотностью раствора (D) или его экстинкцией (Е). Упрощенная формула записи закона Ламберта–Бера (E=C·L) показывает, что экстинкция прямо пропорциональна толщине слоя и концентрации раствора; это обсто- ятельство и используется в биохимии при фотометрическом определении концентрации веществ с помощью специальных приборов – фотоэлектроколориметров (ФЭК) и спек- трофотометров, позволяющих определять экстинкции растворов. Принципы работы фотоэлектроколориметра. Фотоэлектроколориметр (ФЭК) предназначен для измерения экстинкции прозрачных окрашенных растворов (колори- метрия), а также для измерения величины светорассеяния непрозрачных растворов и суспензий (нефелометрия). Каждый ФЭК снабжен набором светофильтров, позволяю- щих варьировать длину волны света, проходящего через раствор (в переделах видимой части спектра), а также комплектом стеклянных кювет с различными расстояниями между рабочими гранями для проведения измерения при различной толщине слоя рас- твора (L). Принципиальная оптическая схема ФЭКа представлена на рисунке. Пучок света от источника (1) падает на призму (2), которая делит его на два по- тока: левый и правый. Левый световой поток является компенсационным, правый – из- мерительным. Отразившись от зеркала (3) и пройдя через светофильтры (4), пучки све- та идут параллельно, проходя через кюветы (5), и попадают на фотоэлементы (9), со- 8 3 3 4 5 6 9 1 2 4 5 3 3 7 9 60 единенные с гальванометром. В правый поток света помещают опытную (с раствором) или контрольную (с растворителем) кюветы; в левом потоке всегда находится только кювета с растворителем. При равенстве световых потоков, падающих на фотоэлемент, стрелка гальванометра находится в среднем (нулевом) положении. Если правый свето- вой пучок проходит через кювету с окрашенным или светорассеивающим раствором, то его интенсивность ослабляется, по сравнению с левым пучком, проходящим через кю- вету с растворителем. Выравнивание интенсивностей световых потоков проводят с по- мощью специальных барабанов – левого (7) и правого (8), при вращении которых све- товые потоки регулируются с помощью раздвижных диафрагм (6). При проведении колориметрических или нефелометрических измерений в пра- вый световой поток сначала помещают кювету с исследуемым раствором и уравнивают потоки вращением левого барабана, а затем – кювету с контролем, и уравнивают пото- ки правым барабаном. Промышленность выпускает ряд моделей колориметров, имеющих весьма сход- ные конструкции и различающихся только особенностями фотоэлементов и количе- ством светофильтров. Ниже приведено краткое описание прибора КФК-2. Колориметр фотоэлектрический концентрационный (КФК-2) предназначен для количественного определения веществ в окрашенных растворах по их оптической плотности или коэффициенту светопропускания в диапазоне волн 315-980 нм. КФК-2 состоит из оптического блока (передняя часть прибора), где находятся осветитель, све- тофильтр, оптика, кюветное отделение, фотометрическое устройство и регистрирую- щий прибор, и блока питания (задняя часть), где расположены стабилизатор напряже- ния с выпрямителем и силовой трансформатор. Источником света в колориметре служит галогенная лампа. Приемниками излу- чения являются фотоэлемент Ф-26 для работы в диапазоне волн 315-540 нм и фотодиод ФД-24К для работы в специальном диапазоне 590-980 нм. Световой поток лампы с помощью специальных устройств конденсируется, уси- ливается и проходит через светофильтр, кювету с исследуемым раствором и падает на приемник излучения. При этом световое излучение преобразуется в электрические сиг- налы, которые подаются на измерительный прибор. Показания микроамперметра про- порциональны световому потоку, проходящему через исследуемый раствор. Использование конкретного цветового светофильтра позволяет пропускать через раствор лучи определенной длины волны, поглощение которых характерно для иссле- дуемого вещества. В КФК-2 имеется набор из 11 светофильтров. Приведенная ниже таблица позволяет ориентировочно выбрать светофильтр для измерения оптической плотности некоторых окрашенных растворов. Окраска исследуемого раствора Цвет необходимого свето- фильтра Длина волны пропускаемо- го света, нм Желтая Синий 420–450 Оранжевая Синий 430–460 Красная Зеленый 460–500 Пурпурная Зеленый 490–530 Синяя Оранжевый 590 Сине-зеленая Красный 600–650 Голубая Красный 750 Сине-фиолетовая Красный 750 61 Обычно эффективную длину волны и цвет светофильтра указывают в использу- емом методе. Известно, что чем толще слой жидкости, через который проходит луч света, тем больше поглощение светового пучка и тем выше показание оптической плотности ис- следуемого раствора. К колориметру прилагается набор кювет, отличающихся расстоя- нием между рабочими гранями, через которые проходит световой поток. Это расстоя- ние (в мм) указано на одной из рабочих граней. На боковой стенке кювет имеется мет- ка, до которой необходимо наливать жидкость. При работе с летучими растворами кю- веты закрывают специальными крышками. Набор кювет обеспечивает возможность работы с толщиной слоя исследуемого раствора от 1 до 50 мм. Подбор кювет осуществляется таким образом, чтобы оптиче- ская плотность исследуемого раствора не была ниже величины 0,15 и выше 0,7. Пред- варительный выбор кювет производится визуально, соответственно интенсивности и окраски раствора. Если раствор интенсивно окрашен, следует пользоваться кюветами с малой рабочей длиной. В случае слабоокрашенных растворов рекомендуется работать с кюветами большей рабочей длины. Все кюветы перед каждым измерением тщательно промывать и высушивать. Не касаться рабочих стенок кюветы пальцами! Общая схема прибора КФК-2 и обозначения 1 Рукоятка установки светофильтра (около рукоятки маркировка по длине волны). 2 – Ручка перемещения кювет в кюветном отделении. 3 – Ручка включения чувствительности фотоприемников (обозначена цифрами 1, 2 и 3 черного цвета при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм и красного цвета – в диапазоне от 590 до 980 нм). 4 – Микроамперметр (по верхней шкале измеряют коэффициент светопропускания (от 0 до 100%), а по нижней – оптическую плотность раствора (от 0 до 1,5). 5 – Ручка «грубой» настройки микроамперметра. 6 – Установка «точной» настройки микроамперметра. 7 – Крышка кюветного отделения. 62 Правила работы на КФК-2 I. Подготовка прибора к работе 1. Установить нужный светофильтр (рукояткой 1). 2. Рукоятку 3 (чувствительность фотоэлемента) установить на цифру 1 соответствую- щего цвета: при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм чувствительность обозна- чена цифрами черного цвета и в диапазоне от 590 до 980 нм – красного цвета. 3. Проверить, выключен ли микроамперметр (рукоятки 5 и 6 должны быть повернуты до отказа влево). 4. Прибор включить (вилку в сеть; тумблер, расположенный на задней стенке в ниж- нем левом углу, переключить в положение «вкл»). При этом загорается лампочка накаливания. 5. Прибор прогреть в течение 15-20 минут. II. Измерение оптической плотности раствора 1. Кювету с контролем или растворителем поставить в дальнее (от исследователя) гнездо кюветодержателя; кювету с исследуемым раствором (опытом) – в ближнее гнездо кюветодержателя. 2. Кювету с контролем (или растворителем) поместить в световой поток поворотом ручки 2 до отказа влево. 3. Закрыть крышку кюветного отделения (7). 4. Установить стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале поворотом ручки 5 («грубой» настройки). В случае необходимости воспользоваться ручкой 6 («точной» настройки). жүктеу/скачать 1.21 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|