Методическое пособие к малому практикуму по биохимии и молекулярной биологии
жүктеу/скачать 1.21 Mb. Pdf көрінісі
|
|
Работа 3. Осаждение белков Два основных фактора позволяют удерживаться тяжѐлым молекулам белка в растворе. Во-первых – это наличие гидратной оболочки; во-вторых – наличие заряда у белковой молекулы. Гидратная оболочка - это слой мо- лекул воды, определенным образом ориентированных на поверхности бел- ковой молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена отрицательно, и диполи молекул воды притягиваются к ней своими поло- жительно заряженными полюсами. Чем больше гидрофильных свойств у белковой молекулы, чем больше в ее составе и на ее поверхности амино- кислот с полярными (гидрофильными) радикалами, тем сильнее выражена и прочнее удерживается гидратная оболочка и тем больше в ней слоев. Во- да гидратной оболочки обладает особыми свойствами: она не является свободной, она связана с белковой молекулой – это “связанная” вода. Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белко- вым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок. Чтобы оса- дить белок из раствора, надо лишить его обоих факторов стабилизации: и заряда, и гидратной оболочки. Реакции осаждения белков весьма разнообразны. В зависимости от применяемого реагента они могут быть обратимыми или необратимыми. К необратимым относятся реакции осаждения белков солями тяжелых ме- таллов, нагреванием, минеральными и органическими кислотами. Обрати- мые реакции осаждения белков можно провести, используя в качестве оса- дителя органические растворители (на холоде) либо соли щелочных ме- таллов. Глубоких изменений в молекуле белка не происходит, поэтому по- лученный осадок хорошо растворяется в исходном растворителе, и белок полностью сохраняет свои нативные свойства. 1. В ы с а л и в а н и е б е л к о в . Это обратимое осаждение белков из раствора путем добавления нейтральных солей (особенно сульфатов) в вы- соких концентрациях. При высаливании происходит дегидратация молекул белков и устранение заряда. Процесс осаждения зависит от молекулярной массы и заряда белка, степени гидрофильности. 13 Ход исследования К 20 каплям раствора яичного белка приливают по стенке равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. На границе жидкостей образуется белое кольцо – осадок глобулина. Содержимое пробирки филь- труют, а к фильтрату, помешивая стеклянной палочкой, добавляют малы- ми порциями порошок сульфата аммония, до полного насыщения раствора. Раствор мутнеет – осаждаются альбумины. Половину содержимого про- бирки переносят в чистую пробирку и прибавляют 20 капель дистиллиро- ванной воды. Осадок растворяется. Объяснить полученные результаты. 2 . О с а ж д е н и е б е л к а с п и р т о м , а ц е т о н о м основано на дегидра- тации молекул белка. Кратковременное воздействие спирта на холоде не нарушает структуры белка, при комнатной температуре происходит дена- турация белка. Ход исследования К 10 каплям раствора альбумина добавляют 10 капель этанола. От- мечают осаждение белка. Затем в пробирку наливают 20 капель дистилли- рованной воды – осадок не растворяется. 3 . Осаждение белка кислотами . Концентрированные минераль- ные и некоторые органические кислоты вызывают денатурацию белковых молекул. Кроме того, минеральные кислоты дегидратируют молекулы бел- ка. Ход исследования В две пробирки наливают по 10 капель раствора альбумина. Затем в первую пробирку добавляют 5 капель 10 %-ной трихлоруксусной кислоты, во вторую – 5 капель концентрированной азотной кислоты. Отмечают вы- падение осадка, не исчезающего при добавлении воды. 4 . О с а ж д е н и е б е л к а с о л я м и т я ж е л ы х м е т а л л о в . Ионы тяже- лых металлов при взаимодействии с белками (особенно с группами SH) образуют нерастворимые в воде комплексы. Белок при этом подвергается денатурации. Ход исследования В две пробирки наливают по 10 капель раствора альбумина. В первую пробирку прибавляют 2 капли 2 %-ного раствора сульфата меди, во вторую – 2 капли 5 %-ного раствора ацетата свинца. Отмечают появле- ние осадка, не исчезающего при добавлении воды. 5 .Осаждение б елка при на гревании . При нагревании раство- ра белка до 60 70 ºС происходит, как правило, выпадение белка в осадок. 14 Это связано с глубокими нарушениями структуры белковой молекулы. Важную роль в осаждении денатурированного белка играет концен- трация водородных ионов (pН). Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке белка. В сильнокислых и сильноще- лочных растворах денатурированный при нагревании белок не выпадает в осадок, так как молекулы белка несут в первом случае положительный, а во втором отрицательный заряд. Ход исследования В четыре пронумерованные пробирки наливают по 10 капель раство- ра альбумина. Затем во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1 %-ного рас- твора уксусной кислоты, в третью – 5 капель 10 %-ного раствора уксусной кислоты, в четвертую – 5 капель 10 %-ного раствора едкого натра. Все про- бирки нагревают до кипения и отмечают отсутствие или выпадение осадка, а также его характер. Объяснить результаты. Полученные данные внести в таблицу. Название групп осадителей Употребляемые реактивы Характер осадка Чем обусловле- но осаждение 1. Нейтральная соль а) (NH 4 ) 2 SO 4 раствор Белое кольцо (глобулин) Дегидратация белка, снятие заряда б) (NH 4 ) 2 SO 4 кристаллический Помутнение раствора (альбумин) “ – “ в) Н 2 О дистиллированная Растворение осадка Обратимость осаждения 2. И так далее После оформления таблицы сделать выводы: а) о возможности обратимого и необратимого осаждения белка; б) об основных механизмах осаждения белка; в) о практическом применении реакций осаждения белка. жүктеу/скачать 1.21 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|