Работа 6. Обессоливание белкового раствора при помощи гель-

18 
еме, равном сумме наружного и внутреннего (V
o
+ V
i
). Объем наносимого 
образца при обессоливании может составлять 20 – 30% от общего объема 
колонки. 
Обессоливание с помощью сефадексов происходит гораздо быстрее и 
с меньшей потерей белка, чем при диализе. 
Ход исследования 
Укрепляют колонку строго вертикально. Сначала открывают верх-
нюю, а затем нижнюю пробки, промывают колонку дистиллированной во-
дой. ВНИМАНИЕ! Как только весь необходимый объем элюента будет 
пропущен через колонку, ее следует закрыть, не допуская пересыхания се-
фадекса! 
1. К а л и б р о в к а к о л о н к и . Основная задача калибровки состоит в 
том, чтобы определить главные параметры колонки: наружный объем V
o
и 
внутренний объем V
i
. V
o
- это объем, занимаемый буфером, находящимся 
вне гранул сефадекса (подвижная фаза), а V
i
– объем буфера, находящегося 
внутри всех гранул геля (неподвижная фаза). Очищаемый белок выходит в 
объеме элюата в пределах между V
o
и V
i
. 
Для определения этих характеристик в колонку загружают смесь 
0,2%-ного раствора голубого декстрана и 0,2%-ного раствора хромата ка-
лия (1:1), объемом не более 2% от общего объема колонки (для колонки 
объемом 10 мл это составляет примерно 160 мкл). Калибровочную смесь 
наносят на сухой верхний фильтр колонки, сразу же после нанесения 
начинают сбор фракций по 0,5 мл в градуированные пробирки. После того, 
как калибровочная смесь полностью войдет в колонку, проводят элюцию 
дистиллированной водой до полного выхода хромата калия. Полученные 
результаты записать в виде рабочей таблицы, отмечая примерное содержа-
ние компонентов калибровочной смеси («-» – отсутствует, «+», «++», 
«+++» - разное содержание). 
№ фрак-
ции
Присутствие голубого 
декстрана 
Присутствие хромата ка-
лия 
1.
2.
3.
4.
Используя полученные данные, рассчитывают объем элюции V
е
для 
голубого декстрана и для хромата калия. 
Объем элюции V
е
(мл) равен объему элюата, собранному после нане-
сения образца на колонку до появления максимальной концентрации его в 
соответствующей фракции. Объем элюции V
е
голубого декстрана пример-
но равен наружному объему колонки, объем элюции V
е 
хромата калия – 

19 
сумме наружного и внутреннего. Рассчитывают параметры колонки и 
представляют их в виде заполненной таблицы: 
Тип геля 
Сефадекс G-25 
Элюент 
V
е
голубого декстрана = V
o
Vе хромата калия 
V
i
колонки 
После окончания калибровки колонку промывают несколькими объе-
мами дистиллированной воды. 
2. О б е с с о л и в а н ие а л ь б у м и н а . На промытую дистиллированной 
водой колонку наносят пробу для обессоливания (200 мкл). Тотчас же по-
сле нанесения пробы начинают собирать фракции по 0,5 мл в градуиро-
ванные пробирки, в каждой определяют наличие белка и сульфата аммо-
ния. Сульфат аммония выявляют по качественной реакции с уксуснокис-
лым свинцом (добавлять по 1 капле и перемешать). Появление при этом 
мути указывает на наличие ионов сульфата. Присутствие белка определя-
ют при помощи биуретового реактива (добавить по 2-3 капли). 
Полученные результаты также отображают в виде рабочей таблицы, 
отмечая содержание белка и соли. 
№ 
фракции
Присутствие 
белка 
Присутствие
соли 
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Используя данные таблицы определяют, в каком объеме снимается с 
колонки весь белок, через какой объем элюата начинает выходить соль. На 
основании полученных данных рассчитывают объемы элюции альбумина и 
сульфата аммония. После определения объемов элюции белка и соли срав-
нить их с данными калибровки и сделать вывод о возможном применении 
гель-фильтрации. 
ВНИМАНИЕ! По окончании эксперимента промыть колонку несколь-
кими объемами дистиллированной воды и тщательно ее закрыть, просле-
див, чтобы над поверхностью сефадекса остался слой жидкости. 

жүктеу/скачать 1.21 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: