Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя чумы из природных очагов разного типа 03. 00. 07 микробиология
жүктеу/скачать 1.84 Mb.
|
|
Штамм Y. pestis № 2730 (Приэльбрусский автономный очаг) также не содержал в геноме ген caf1, не имел плазмиды pFra и не проявлял соответствующих фенотипических свойств, т. е. был F1– отрицателен при исследовании в РНГА, Western blot и МФА (таблица 6). Таблица 6 – Результаты обнаружения антигена F1 Y. pestis различными методами у штаммов из очагов чумы СНГ
Для молекулярного типирования возбудителя чумы методом ПЦР мы использовали и мультилокусную систему позволяющую выявлять фрагменты генов, соответствующих трем собственным плазмидам чумного микроба (pFra, pCad, pPst) и хромосомному гену 16S рРНК (CDC, USA) (рисунок 7). 
1 – маркеры молекулярных масс; 2, 3, 5-8 и 11 – штаммы Y. pestis, имеющие все четыре гена; 4, 9, 10 – штаммы Y. pestis, не имеющие pst-гена; 12 – отрицательный контроль Рисунок 7 – Электрофореграмма амплификации продуктов мПЦР Детекция продуктов амплификации методом электрофореза в полиакриламидном геле, позволила установить, что универсальный праймер, мишенью в ПЦР у которого является рибосомный ген (16S рРНК), амплифицировал фрагменты гена у всех исследуемых культур чумного и псевдотуберкулезного микробов. Мультилокусная система позволила также выявить фрагменты генов, соответствующих трем собственным плазмидам. Фрагмент амплифицируемый прямым и обратным праймерами Pst5/Pst3 не выявлен у штаммов Y.pestis, утративших плазмиду пестициногенности (pPst). У штаммов, не имеющих плазмиды (кальцийзависимости) pCad, соответствующие ампликоны в мПЦР не обнаружены (таблица 7). Таблица 7 – Результаты мультилокусной ПЦР в сравнении с результатами плазмидного анализа
Амплификация в одной реакционной смеси фрагментов генов, локализованных на трех плазмидах Y. pestis, дает возможность составить представление об их потенциальной вирулентности и эпидемической значимости. Проведено сравнительное изучение плазмидных профилей штаммов Y. pestis, циркулирующих в различных природных очагах, среди различных носителей и переносчиков, в пределах одного очага на протяжении длительного времени. Выявлено 6 вариантов штаммов Y. pestis, отличающихся по наличию плазмидных репликонов. Скрининг штаммов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах Казахстана показал преобладание типичного плазмидного профиля (110 kb, 70 kb, 9,5 kb), характерного для 95,2±12,5% штаммов (рисунок 8). Представляют интерес криптическая плазмида размером 45-50 kb штамма № 1969, выделенного от больного человека и плазмида с измененной массой 120 kb, что важно для дифференциации природных вариантов от созданных лабораторно путем введения дополнительных факторов вирулентности. 
1 – маркеры молекулярных масс; 2, 6, 7 – тип 12 (70 и 9,5 kb); 3, 5 – тип 13 (70 kb); 4 – тип 6 (110 и 70 kb); 8 – тип 14 (9,5 kb); 9 – тип 2 (110, 70, 45-50 и 9,5 kb); 10 – тип 1 (110, 70 и 9,5 kb). Рисунок 8 – Электрофореграмма плазмидного профиля штаммов чумного микроба Типичный плазмидный профиль также преобладал в популяциях чумного микроба, циркулирующего в природных очагах стран СНГ. Незначительные колебания молекулярной массы плазмиды pFra не носили характера выраженной закономерности. Подтверждена возможность элиминации плазмид чумного микроба в процессе хранения при многократных пересевах штаммов на искусственные питательные среды и под воздействием других факторов, в результате чего изменяется их плазмидный состав и вирулентные свойства. Как видно на рисунке 9 и у музейных, и у свежевыделенных штаммов чаще всего элиминирует плазмида пестициногенности. Плазмида pFra чаще отсутствовала у музейных штаммов. У свежевыделенных штаммов не отмечено такого разнообразия вариантов элиминации плазмид, как – у музейных.  
А – музейные штаммы Б – свежевыделенные штаммы Рисунок 9 - Частота элиминации плазмид у штаммов чумного микроба В целом, плазмидный состав штаммов чумного микроба из очагов чумы Казахстана был представлен вариантами: 1) типичный 110 kb, 70 kb, 9,5 kb и специфичный 120 kb, 70 kb, 9,5 kb; 2) атипичный: - с дополнительной плазмидой 110 kb, 70 kb, 45-50 kb, 9,5 kb - с отсутствием одной или нескольких плазмид: 110 kb, 70 kb 110 kb, 9,5 kb 110 kb
70 kb, 9,5 kb 70 kb
9,5 kb. В процессе работы создана коллекция из 17 штаммов Y. pestis, отличающихся по плазмидному составу. Простота выполнения и ограниченное время процедуры скрининга плазмид позволяют в достаточно короткие сроки получить характеристику исследуемых штаммов по плазмидному профилю. Штаммы чумного микроба, циркулирующие в природных очагах Казахстана, имеют сходный протеиновый профиль, типичный для вида Y. pestis. Клеточный экстракт всех изученных чумных микробов содержал набор белков с молекулярной массой в пределах от 17 до 103 kDa. Приблизительно 18 полипептидов выявлено в каждом из штаммов. Среди них – 7 белков с приблизительной молекулярной массой 90, 80, 64, 46, 38, 29 и 17 kDa преобладали в количественном отношении, являясь основными (мажорными) белками чумной клетки. Кроме того, в клеточной мембране Y. pestis присутствовали второстепенные (минорные) белки размером ~ 103, 100, 61, 43, 39, 35, 33, 28, 27, 25 и 20 kDa (рисунок 11).
Казахстана и США Степень подобия у казахстанских штаммов находится в диапазоне 94-100%, что указывает на высокую степень структурной близости клеточных мембран. Получен референс-спектр мембранных белков возбудителя чумы, циркулирующего в природных очагах Казахстана. Р 1 – маркеры молекулярных масс. Положительно реагирующие с анти-F1 сывороткой штаммы Y. pestis: 2 – штамм А1122 из США; 3, 5, 7, 9, 10 – из природных очагов Казахстана. Слабо реагирующие с анти-F1 сывороткой штаммы Y. pestis: 6, 8 – из природных очагов Казахстана. Не реагирующий с анти-F1 сывороткой штамм Y. pestis: 4 – штамм № 23 из Прибалхашского автономного очага. Рисунок 12 – Иммуноблоты клеточных лизатов Y. pestis с кроличьей анти-F1 сывороткой и коньюгатом антикроличьих антител с щелочной фосфатазой Результаты тестирования капсульного антигена методом Вестерн блота были сопоставимы с результатами серологического исследования штаммов в системе серологических реакций РНГА-РНАт. Выявленный методом ГЭИП полиморфизм позволяет говорить о неоднородности штаммов чумного микроба, циркулирующих в природных очагах Казахстана на фоне сходства их некоторых фенотипических признаков. На рисунке 13 представлена диаграмма результатов изучения штаммов методом гель-электрофореза в импульсном поле. Процент идентичности штаммов из автономных очагов Среднеазиатского пустынного природного очага, Волго-Уральского степного автономного очага, Волго-Уральского песчаного природного очага независимо от года изоляции составляет от 77,2 до 97,7%. Биотип изученных штаммов возбудителя чумы из этих географических регионов – mediaevalis. Исключение составляет штамм, изолированный из Устюртского автономного очага KZ993790, который обладает способностью к денитрификации и генетически близок (84,45%) к штамму KZ993831 из Тянь-Шанского природного очага (Сарыджазский автономный очаг) и по биохимическим свойствам штамм отнесен к биотипу antigua. Последние два штамма возбудителя чумы по генетической структуре более близки к штаммам из США (83,17%), в сравнении с другими штаммами, выделенными из очагов чумы Казахстана (77,16%) (таблица 8).
в импульсном поле У штаммов из Сарыджазского автономного очага процент схожести относительно низкий (77,16%). Схожесть генетической структуры 12 штаммов, изолированных в США, варьирует от 88,79% до 100%. Относительно низкий процент идентичности штаммов, изолированных из очагов чумы Казахстана (77,16%–97,68%), зависит от неравнозначности участков с ландшафтно-эпизоотологической точки зрения, с характерными для каждого очага свойствами циркулирующих популяций возбудителя чумы. Таблица 8 – Результаты изучения идентичности штаммов Y. pestis из разных очагов Казахстана и США
VNTR-анализ позволил установить генотипы штаммов Y. pestis, распространенных на территории Казахстана; построена дендрограмма генетических взаимоотношений штаммов, что позволило все изоляты разделить на 7 кластерных групп. Подобраны отличительные молекулярно-генетические маркеры как между различными кластерами, так и между штаммами внутри одного кластера. В результате кластерного анализа была построена консенсусная дендрограмма филогенетического сходства изученных штаммов Yersinia pestis, построенная по принципу невзвешенного попарно-группового метода или метода ближайшего соседа. На филогенетическом древе выявляются семь основных кластеров, поддерживаемых довольно высокими бутстреп значениями (52-96% в рамках 37% делеций и 500 репликаций) (рисунок 14). Дендрограмма филогенетических связей между штаммами позволяет с довольно высокой долей вероятности определить их происхождение Дальнейшее расширение и уточнение базы данных позволит создать электронную карту распределения генотипов Yersinia pestis на энзоотичных по чуме территориях 
Рисунок 14 – Дендрограмма филогенетического сходства изученных штаммов Y. pestis, полученная методом VNTR Проведенные исследования позволили проследить динамику вирулентности штаммов чумного микроба на одном из участков Мангышлакского автономного очага чумы (Горно-Мангышлакский ЛЭР), где протекала острая разлитая эпизоотия в период 2001-2005 гг. (рисунок 15). 
Рисунок 15 – Динамика эпизоотического проявления в Горно-Мангышлакском ландшафтно-эпизоотическом районе в 2001-2005 гг. Результаты изучения вирулентности штаммов Y.pestis, изолированных в ходе эпизоотического процесса на одном из участков Мангышлакского автономного очага чумы (Горно-Мангышлакский ЛЭР), показали динамичность признака кальцийзависимости и вирулентности для лабораторных животных. К концу эпизоотического процесса имелась тенденция к уменьшению процента Са- клеток у штаммов чумного микроба, однако различия по признаку кальцийзависимости были недостоверными (рисунок 16). 
Рисунок 16 – Кальций-зависимость штаммов Y.pestis и динамика эпизоотического процесса в Горно-Мангышлакском ЛЭР в 2001-2005 гг. В отличие от признака кальцийзависимости различия вирулентности штаммов для лабораторных животных были достоверными. Наиболее вирулентными оказались штаммы, изолированные в разгар эпизоотии (таблица 9). Таблица 9 – Вирулентность для белых мышей штаммов Y.pestis в ходе эпизоотического процесса в Горно-Мангышлакском ландшафтно-эпизоотическом районе в 2001-2005 гг.
Что касается способности штаммов Y.pestis усваивать гемин на среде Джексона-Берроуза, то процентное соотношение Рgm+(пигментированных) и Рgm- (не пигментированных) колоний в популяции штаммов, циркулирующих в ходе эпизоотии, практически не изменилось (рисунок 17), также как и количество продуцируемой FI (рисунок 18). 
Рисунок 17 – Pgm+ признак штаммов Y.pestis и динамика эпизоотического процесса в Горно-Мангышлакском ЛЭР (2001-2005 гг.) 
Рисунок 18 – Количество FI (мкг/мл) у штаммов Y.pestis и динамика эпизоотического процесса в Горно-Мангышлакском ЛЭР в 2001-2005 гг. В процессе выполнения работы получены аналогичные данные и по другим очагам чумы. Таким образом, признаки штаммов чумного микроба, связанные с вирулентностью, практически не меняются в ходе эпизоотического процесса. Вместе с тем, вирулентность штаммов для лабораторных животных достоверно различается в начале и в конце эпизоотии. Наиболее вирулентные штаммы циркулируют в разгар эпизоотии, что многократно повышает степень риска заболевания людей. Подтверждением этому явились случаи заражения людей на территории Горно-Мангышлакского ландшафтно-эпизоотологическом районе (ЛЭР) летом 2003 года (3 человека). Причиной заражения явился забой и разделка туши больного верблюда. Сравнительное изучение вирулентности штаммов чумного микроба, изолированных от больных людей (Y.pestis №№ 3360, 3361, 3363, 3364, 3366), из мяса больного чумой верблюда (Y.pestis №№ 3362, 3365), из почвы на месте забоя верблюда (Y.pestis 3367), от больших песчанок, добытых в районе заболевания людей (Y.pestis №№ 3369, 3370) и их эктопаразитов (Y.pestis №№ 3298, 3436) показало абсолютное сходство изолированных штаммов Y.pestis по всем признакам и вирулентности для лабораторных животных (таблица 10). Все штаммы, изолированные в период эпидемиологического проявления чумы в Горно-Мангышлакском ландшафтно-эпизоотическом районе в 2003 году, имели сходный протеиновый профиль: у всех обнаружена F1 в Вестерн блоте. Плазмидный профиль штаммов был типичным. В мультилокусной ПЦР у всех штаммов обнаружены гены F1, Rep, Pst. Таким образом, сходство штаммов подтверждено и генетическими методами.
Определение вирулентности того или иного штамма обычно проводят в опытах заражения лабораторных животных с вычислением LD50. Применение культур клеток в бактериологической диагностике чумы позволяет значительно расширить методические приемы в изучении биологической характеристики микроорганизма. С целью изучения вирулентности штаммов возбудителя чумы и других возбудителей зоонозов был испытан метод определения вирулентности штаммов in vitro на монослое культуры клеток фибробластов цыплят. При микроскопии монослоев клеточных культур установлено, что высоковирулентные штаммы Y. pestis взаимодействовали с клетками уже через 10-12 часов (таблица 11). Развитие патологии клеток начиналось с признаков колонизации клеточного монослоя, который подвергался постепенной деструкции. Клетки истончались, деформировались, нарушались межклеточные связи, затем происходило отслоение части клеток, в результате чего появлялись участки разряжения, которые в последующем увеличивались и сливались. Из клеток формировались очаговые гроздевые скопления. Отмечены различия в кинетике и итоге взаимодействия с клеткой высоко вирулентных и менее вирулентных штаммов. Если слабовирулентные штаммы проявляли цитопатическое действие с активностью ТЦД100 только при дозе 1.105 м.к., то высоковирулентные штаммы при заражающей дозе всего 1.102 м.к. Таким образом, модель клеток для создания тест-систем (с использованием монослоя клеток фибробластов цыплят) может быть использована для определения патогенности (уровня вирулентности) бактерий рода Yersinia в условиях бактериологических лабораторий in vitro. Таблица 11 – Результаты испытания штаммов чумного микроба на модели культуры клеток (в процентах)
В результате проведенного мониторинга свойств штаммов чумного микроба нами разработана и внедрена схема, которая предусматривает применение классических микробиологических и молекулярно-генетических методов изучения. Проводится скрининг фенотипических свойств штаммов традиционными микробиологическими методами и в результате отбираются штаммы типичные и атипичные по фенотипу. Для изучения свойств молекулярно-генетическими методами отбираются типичные штаммы от носителей и переносчиков (по одному штамму из каждого очага от каждого вида носителей и переносчиков). У этих штаммов изучается плазмидный профиль. В случае наличия всех трех плазмид (типичный плазмидный профиль) можно ограничиться исследованием в ПЦР на наличие только гена pFra. В случае отклонений в плазмидном профиле (отсутствие плазмид или наличие дополнительных плазмид) штаммы необходимо исследовать в мультилокусной ПЦР. Несколько иной подход, по нашему мнению, должен применяться при изучении атипичных по фенотипу штаммов. Для полной характеристики все атипичные по фенотипу штаммы следует исследовать по развернутой методике. Эти штаммы подлежат и изучению методами протеинового профиля и Вестерн блота, позволяющие выявить возможные особенности протеинограмм и подтвердить наличие (отсутствие) F1. Штаммы также изучаются методами плазмидного профиля, и у исследователей появляется возможность сопоставления данных, полученных по вирулентности штаммов с плазмидным составом. И далее штаммы необходимо изучить в мультилокусной ПЦР с использованием трех пар праймеров в одной реакционной смеси для определения генов, локализованных на трех собственных плазмидах возбудителя чумы. Это увеличивает вероятность выявления штаммов, дефектных по каким-то плазмидам, повышая надежность и информативность исследований (рисунок 19). 
Рисунок 19 – Схема изучения штаммов Y. pestis Не вызывает сомнения необходимость проведения комплексного изучения штаммов стандартными и молекулярно-генетическими методами при эпидемиологических проявлениях чумы. Молекулярные методы диагностики микроорганизмов способны не только помочь проследить эпидемическую цепочку, но и решать общие задачи микробиологии, эпидемиологии и эволюции чумного микроба. Они не являются заменой традиционных микробиологических методик, а их существенным и необходимым дополнением. Особую важность эти методы приобретают для быстрой диагностики в случаях актов биотерроризма и для определения происхождения возбудителя, так как позволяют дифференцировать генетические изменения в ДНК клеток, а при сопоставлении свойств, определить источник. Кроме того, применение молекулярных методов в комплексной системе мониторинга свойств штаммов чумного микроба – инструмент, который может использоваться для получения информации об этиологическом агенте, которая не может быть получена традиционными методами. Когда стандартные микробиологические методы будут не в состоянии изолировать жизнеспособную клетку, молекулярные тесты могут быть единственно способными подтвердить присутствие Y. pestis. Комплексное изучение свойств штаммов Y. pestis, включающее классические микробиологические и молекулярно-генетические методы исследования, позволяет проводить полное эпидемиологическое слежение за распространенностью различных вариантов возбудителя чумы в природных очагах чумы, получая дополнительные характеристики свойств или обнаружить признаки, отличающие штаммы не только из разных очагов чумы, но и внутри одного очага. Быстрота выполнения (5 – 6 часов) и высокая чувствительность ПЦР позволяют рекомендовать ее использование для прямого обнаружения Y. pestis в материале, используемом при лабораторном анализе на чуму (кровь, ткани, органы, блохи и др.). В своей работе мы использовали молекулярно-генетические методы детекции чумного микроба в исследовании полевого материала. Для обнаружения возбудителя чумы методом использовали ПЦР тест-системы на основе одновременной амплификации генов плазмидной локализации caf1 гена (pFra), pla гена (pPst) и yop A гена (pCad). При исследовании эмульсий органов грызунов из Северо-Приаральского автономного очага чумы методом ПЦР были обнаружены специфические для чумного микроба гены: c праймерами EC9-EC11; Pst3-Pst5; Rep1-Rep2; F1-1-F1-2 (рисунок 20). 
1 – молекулярный маркер; 2, 3 – отрицательные пробы; 4 – отрицательный контроль; 5 – положительный контроль; 6 – Y. pestis EV; 7 – Y. pseudotuberculosis; 8 -12 – положительные пробы а – фрагмент c праймерами EC9-EC11; b – фрагмент с праймерами Pst3-Pst5; c – фрагмент c праймерами Rep1-Rep2; d – фрагмент c праймерами F1-1-F1-2 Рисунок 20 – Результаты ПЦР с эмульсиями органов большой песчанки из Северо-Приаральского автономного очага чумы Полученные данные результатов ПЦР совпали с результатами эпизоотологического обследования данной территории, на которой были выделены культуры чумного микроба от большой песчанки. Кроме того, методом ПЦР в пробе гамазовых клещей, снятых с очеса краснохвостой песчанки был получен положительный результат с праймерами PlaY1-PlaY2 при отрицательных результатах стандартных методов исследования (рисунок 21). 
1 – молекулярный маркер; 2-5; 6 – положительная проба эктопаразитов, 7-10 – отрицательные пробы эктопаразитов; 6-положительная проба эктопаразитов; 11 – положительный контроль; 12 – отрицательный контроль; а – фрагмент c праймерами PlaY1-PlaY2; b – фрагмент с праймерами F21-F22 Рисунок 21 – Результаты исследования методом ПЦР проб эктопаразитов на чуму в 2004 году в Северо-Приаральском автономном очаге Применение ПЦР отражено в соответствующих приказах и инструкциях МЗ РК только при исследовании материала от больного на чуму. Полученные нами результаты позволяют рекомендовать скрининговые ПЦР исследования групповых эмульсий органов грызунов и эктопаразитов на новых территориях, что позволит получить в короткие сроки и с высокой чувствительностью и специфичностью предварительные данные о наличии (отсутствии) ДНК возбудителя чумы в пробах. В случае положительных находок на эпидемически опасных территориях (наличие постоянного или временного населения, промышленное освоение территории) следует провести лабораторное исследование по традиционной схеме с применением стандартных методов диагностики для определения границ эпизоотии чумы и ее интенсивности. Для целей микробиологического мониторинга Y. pestis с использованием ГИС-технологии нами создана электронная база данных по атипичным штаммам чумного микроба и созданы электронные карты территориального распределения атипичных по фенотипическим и генотипическим признакам штаммов чумного микроба. На рисунке 22 представлено территориальное распределение штаммов Y.pestis по результатам изучения плазмидного профиля в природных очагах чумы Республики Казахстан.
жүктеу/скачать 1.84 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
