Модуль «фармацевт-токсиколог» учебно-методический комплекс
жүктеу/скачать 4.88 Mb.
|
| Оптические методы (Калетина Н.И.-Метаболизм и определение токсиканто.-М.-ГЭОТАР-Медиа.-2008.-С. 753-759)
Объектами исследования на СО являются главным образом кровь пострадавшего и воздух производственных или жилых помещений, содержащий СО. Диагностическое значение имеет определение НЬСО в крови, взятой непосредственно на месте происшествия, так как при оказании пострадавшему первой помощи происходит частичная элиминация угарного газа и снижается содержание НЬСО в крови. Спектрофотометрический метод определения СО наиболее распространен, потому что все гемоглобиновые структуры имеют абсорбцию в определенной части спектра. Метод Рооке является наиболее подходящим при определении низких концентраций НЬСО. Он основан на сравнении спектров поглощения восстановленного гидросульфитом натрия НЬ и НЬСО. который не реагирует с гидросульфитом натрия. Спектры снимают после разбавления крови (0.1 мл) раствором аммиака (50 мл). Измеряют абсорбцию НЬ и НЬСО при 420 и 432 нм. Предварительно определяют молярный коэффициент экстинкции при 420 и 432 нм. При 420 нм абсорбция НЬСО в 2 раза превышает абсорбцию НЬ. а при 432 нм абсорбция НЬ почти в 3 раза больше абсорбции НЬСО. Разница между абсорбцией НЬ и НЬСО при 420 и 432 нм используется при расчете содержания НЬСО по определенной формуле. Метод Рооке несколько громоздок в подготовительной части и математических расчетах, но полученные результаты обычно точны и воспроизводимы. Спектроскопический метод. В основу спектроскопического (микроспектрального) анализа положено свойство гемоглобина и его производных поглощать свет определенной длины волны, поэтому при прохождении луча света через растворы, содержащие гемоглобин пли его производные, в спектре появляются темные полосы поглощения, расположенные в определенной части спектра для каждого производного гемоглобина. В судебно-медицинской практике для этого пользуются микроспектроскопами — приборами, представляющими собой спектроскоп, соединенный с окуляром. Оксигемоглобин (НЬО) имеет в видимой части спектра две полосы поглощения при λ 589— 577 и λ 556—536 нм, восстановленный гемоглобин (НЬ) имеет одну полосу поглощения при λ 596—543 нм, НЬСО — 2 полосы при λ 579—564 и λ 536—523 нм. Кровь для исследования разбавляют водой до тех пор. пока не будут видны при спектроскопическом исследовании две полосы поглощения в желтой и зеленой частях спектра, между линиями Фраунгофера О и Е. Эти линии соответствуют НЬО. При добавлении к жидкости свежеприготовленного (Гм'Н4),8 происходит восстановление НЬО в редуцированный гемоглобин; спустя некоторое время вместо двух полос поглощения появляется одна более широкая полоса, лежащая между двумя ранее бывшими полосами. При спектроскопическом исследовании крови, содержащей СО, также видны две полосы поглощения, принадлежащие НЬСО. При сравнении полученного спектра НЬСО со спектром НЬО оказывается, что эти полосы по своему расположению не совпадают. Добавление сульфида аммония не вызывает восстановления НЬСО. и две полосы поглощения НЬСО не исчезают. При отравлениях не происходит полного насыщения крови СО так как смерть наступает раньше, чем оно произойдет. Поэтому в крови трупа наряду с НЬСО имеется некоторое количество НЬО. После добавления сульфида аммонии при сохранившихся двух полосах НЬСО между ними появляется большее или меньшее затемнение — полоса восстановленного гемоглобина. Количественное определение в крови НЬСО колориметрическим методом (модифицированный метод Вольфа). Этот метод основан на том, что при рН 4,95. температуре 55—60 "С, за 10— 15 мин НЬО. в отличие от НЬСО, выпадает в осадок. Для осаждения НЬСО требуется больше времени. Таким образом, эти два вещества отделяют и НЬСО определяют колориметрически. Строят калибровочную кривую, используя растворы разной степени разведения из образца крови с известным содержанием гемоглобина. Исследуемый образец крови разбавляют 50— 100 раз измеряют светопоглощение и по калибровочной кривой находят концентрацию гемоглобина. Процент насыщения гемоглобина СО определяют по соответствующей формуле. Следует отметить, что метод Вольфа можно использовать для определения СО только в самое ближайшее время после смерти от отравления СО, так как при длительном посмертном сроке белковая часть молекулы меняется, что влияет на растворимость гемопротеинов окси - и НЬСО. Спектрофотометрическии метод Фревурста — Майнеке основан на определении поглощения света определенной длины волны (X 575 или 578 нм) раствором гемолизованной крови до и после восстановления НЬО гидросульфитом натрия. При 100% насыщении крови СО величина поглощения света после добавления гидросульфита натрия не меняется. При неполном насыщении или отсутствии СО она уменьшается. По степени этого уменьшения определяют процент НЬСО в исследуемом образце. Клинические химические лаборатории обычно оснащены автоматизированными дифференциальными спектрофотометрами (СО-оксимеграми). которые одновременно измеряют оптическую плотность гемолизированной крови на 4 и более длинах волн для определения общего гемоглобина, процентного содержания НЬО, НЬСО, метгемоглобина и сульфагемоглобина (см. гл. 2.4). Количественное определение в крови НЬСО спектрофотометрическим методом При добавлении восстановителя (натрия тиосульфата) к исследуемой крови окси- и мет-гемог.тобин количественно образуют восстановленную форму гемоглобина. Последняя имеет спектр поглощения, представленный на рис. 8-16, Б. СО имеет большее сродство к гемоглобину, чем кислород, поэтому комплекс НЬСО не можег быть разрушен тиосульфатом натрия. Таким образом, после обработки тиосульфатом натрия комплекс НЬСО проявляется характерным спектром с двумя максимумами поглощения (рис. 8-16, А). Максимальная разница оптической плотности между спектрами А и Б отмечается при длине волны 540 нм, тогда как при длине волны 579 нм оптическая плотность практически одинакова. Процентное содержание СО в крови (см. рис. 8-16. А) может быть вычислено по формуле, исходя из значения оптической плотности «здоровой», не содержащей НЬСО крови (см. рис. 8-16. Б), и исследуемого образца (см. рис. 8-16. В) после добавления тиосульфата натрия: где х — оптическая плотность. жүктеу/скачать 4.88 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|