Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами
жүктеу/скачать 7.09 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 2. Молекулярно-генетические ДНК-маркеры для оценки и характеристики исходного материала. 2.1. Межсортовой полиморфизм ISSR-маркеров у хмеля обыкновенного
- 2.2. Молекулярно-генетические маркеры для исследования генетического разнообразия и маркирования признаков у малины.
- 2.3. Молекулярно-генетические маркеры для исследования генетического разнообразия и маркирования признаков у огурца . 2.3.1. ISSR полиморфизм.
- Таким образом
- 2.4. Анализ гомологов генов устойчивости к фитопатогенам
- 2.4.1. Огурец.
- 2.4.2. Подсолнечник.
- 3. Разработка и создание ДНК маркеров на хозяйственно-ценные признаки для оценки исходного материала и ускорения селекционного процесса.
- 3.1.1. Рис ( Oryza sativa ) .
|
*Жирным шрифтом обозначены маркеры, интегрированные в генетическую карту (рис. 10). Из 48 ISSR-маркеров, отнесённых к различным группам сцепления, 32 были интегрированы на генетической карте групп сцепления томата относительно уже имеющихся молекулярно-генетических маркеров. 21 маркер показал незначительную степень сцепления, что не позволило отнести их к выявленным группам сцепления и интегрировать в ранее созданную генетическую карту (Рис. 14). Таким образом, картирование ISSR-маркеров генома томатов показало, что межмикросателлитные последовательности и микросателлиты могут располагаться вне прицентромерной области хромосом томата. Этот результат наряду с тем фактом, что метод ISSR-PCR достаточно прост в использовании и хорошо воспроизводим, свидетельствует о высокой потенциальной эффективности использования межмикросателлитных маркеров для дальнейшего картирования генома томата и других видов.
Хромосома 3
Рис.14 . Пример интегрированной генетической карты по третьей группе сцепления А – интегрированная генетическая карта групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата; Б – генетическая карта томата, созданная Tanksley et al. (1992); В – генетическая карта томата созданная Haanstra et al. (1999). Красным цветом на трех картах обозначены области локализации ISSR-маркеров. Синим цветом на карте Haanstra et al. (1999) обозначена область, где AFLP-маркеры располагаются с наибольшей плотностью. Черная вертикальная полоса слева на карте А обозначает приблизительную локализацию прицентромерной области хромосом. Показанная возможность равномерного покрытия генома томата ISSR-маркерами делает их чрезвычайно привлекательным инструментом для маркирования генов хозяйственно-ценных признаков при проведении селекции с помощью маркеров (MAS – Marker Assisted Selection). 2. Молекулярно-генетические ДНК-маркеры для оценки и характеристики исходного материала. 2.1. Межсортовой полиморфизм ISSR-маркеров у хмеля обыкновенного. Структура и организация генома хмеля до настоящего времени мало изучены. Единичные работы посвящены оценке возможности применения некоторых молекулярных маркеров для идентификации сортов хмеля, филогенетических исследований, маркирования пола. Низкий уровень полиморфизма RAPD- и RFLP- маркеров образцов хмеля европейского и североамериканского происхождения выявлен Pillay и Kenny, 1996 и Patzak et al. 1999. В нашей работе проведено исследование межсортового полиморфизма ISSR-маркеров у хмеля обыкновенного. Оценивается возможность применения этого типа маркеров для филогенетических исследований, идентификации сортов хмеля и маркирования хозяйственно-ценных признаков. Продукты амплификации были получены для 21 из 23 протестированных ISSR-праймеров, 19 праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов ДНК. Их размер варьировал от 120 п.н. до 1900 п.н., а количество (учитывали только хорошо различимые фрагменты) – от 5 до 20 фрагментов на 1 праймер (в среднем 9 фрагментов на 1 праймер). Двадцать один праймер обеспечил амплификацию 183 фрагментов ДНК, из них 106 (57,9%) были полиморфными. Уровень полиморфизма, полученный нами для ISSR-маркеров выше AFLP-полиморфизма выявленного Seefelder et al., 2001 – 43,5% и RAPD-полиморфизма, описанного Sustar-Vozlic и Javornik, 2000 – 38,6%. Обнаружены ISSR-маркеры, специфичные для отдельных сортообразцов. К 692266 из Японии: праймер К15 – отсутствует фрагмент размером 550 п.н.; К17 – получен фрагмент 250 п.н., отсутствующий у других сортов. Образец из местной популяции Алтая ЧА 89/19: К16 – отсутствуют фрагменты 300 п.н. и 500 п.н. Сорта Михайловский и Аполлон: отсутствуют отрезки размером 250 п.н. (К22) у первого и 450 п.н. (К24А) у второго. Генетические расстояния и ISSR-группы сортов хмеля. Максимальные значения коэффициентов различия (от 0,45 до 0,53) получены для югославского сорта Аполлон, украинского Сполэчны и российских сортообразцов (Ранний, Чувашский местный, Гуслицкий, Подвязный, Э 88/20, Михайловский, Дружный), японского клона К-692266 и теми же российскими образцами. На основе значений коэффициентов различия был проведен кластерный анализ и построена дендрограмма. Большинство российских сортообразцов, а так же украинский сорт Заклад, Литовский местный и чешский Жатецкий поздний образуют один большой кластер. Европейские сорта, а также небольшая часть российских и украинские сорта образуют второй большой кластер. В нем российские образцы Э 88/20 (Чувашия, образец из местной популяции), Цивильский (НИПТИХ, Чувашия) и Сумерь (РНИСХ) образуют отдельный подкластер. Особняком стоят японский клон К-692266 и образец из местной популяции Алтая ЧА 88/19, которые генетически отдалены как от российских, так и от европейских сортов. До середины XIX века в России выращивали сорта и сортосмеси хмеля, созданные народной селекцией. К концу XIX века после завоза богемских, баварских и английских сортов хмеля они частично заменили российские. Широко применяли интродукцию иностранных сортов в 70-80-х годах XIX века и на Украине. В результате на хмельниках образовывались смеси отечественных и иностранных сортов. Этим можно объяснить например то, что полученный в результате клонового отбора из сортосмеси Житомирской области Клон 18, входит в один кластер с европейскими сортами.Таким образом, в нашей работе выявлен высокий уровень межсортового ISSR-полиморфизма хмеля обыкновенного. Классификация сортов, полученная с помощью ISSR-ПЦР анализа генетического полиморфизма сортов хмеля, отражает существенные генетические различия между российскими, европейскими и дальневосточными группами сортов, но не согласуется с количественными показателями (средние продолжительность вегетации, масса хмеля с растения, содержание альфа-кислот) исследованных сортов. Данные, полученные в результате ISSR-ПЦР анализа, могут быть использованы в селекционном процессе для классификации и идентификации сортов хмеля, подбора пар для скрещивания с учетом их эколого-географического происхождения. 2.2. Молекулярно-генетические маркеры для исследования генетического разнообразия и маркирования признаков у малины. При выборе метода для молекулярно-генетического анализа малины мы, прежде всего, исходили из того, что структура и организация генома малины мало изучены и, следовательно, необходимо опираться на те методы, которые не требуют предварительного знания о последовательности анализируемой ДНК. Также необходимыми условиями при выборе метода для нас были: простота использования, скорость проведения анализа и низкая стоимость. Для изучения полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК видов и сортов малины было использовано 15 ISSR–праймеров. Продукты амплификации были получены для одиннадцати из пятнадцати протестированных праймеров. Десять праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов. В целом эффективными оказались только 8 из 15 ISSR- праймеров. С помощью этих восьми праймеров были получены четкие электрофоретические профили для каждого из генотипов малины. При сравнении ISSR-профилей образцов малины был выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК. С помощью восьми выбранных праймеров оценили генетическое разнообразие видов и сортов малины. Было проанализировано 223 ампликона, из которых полиморфными оказались 202, что составило 90,6 %. В целом выявлено широкое варьирование генетического полиморфизма в зависимости от праймера и группы анализируемых образцов. Всего учитывали 4 группы образцов: виды малины, ремонтантные сорта, обычные сорта и общая группа, объединяющая все сорта и виды. Самый высокий уровень полиморфизма наблюдался в объединенной группе сортов и видов, где он варьировал от 71,4 до 96,8 %, и в среднем составил 89,2%, что можно объяснить тем, что в данной группе наряду с сортами учитывали данные по отдельным видам, которые имели большое количество уникальных фрагментов, специфичных только для данного вида и повышающих общий уровень полиморфизма. Межвидовой полиморфизм колебался в пределах от 66,7 до 94,7 % и в среднем по восьми праймерам составил 82,75 %. Наименьший же уровень полиморфизма наблюдался в группе неремонтантных сортов, где он составил 45,4 % однако, в среднем он составил 74,6 % и был очень близок к среднему уровню полиморфизма ремонтантных сортов – 74,1 %. В целом, как видно из полученных результатов, геном малины отличается высокой степенью полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК. В дендрограмме, построенной на основании результатов, полученных при использовании всех восьми праймеров, наблюдалась четкая кластеризация по группам исследуемых образцов. В частности, выделились все ремонтантные сорта и сорта с летним типом плодоношения, образовав отдельные кластеры. В кластер неремонтантных сортов также попал стародавний сорт Новость Кузьмина, который в наших исследованиях являлся представителем вида малины красной Rubus idaeus L.
Рис. 15. Молекулярное маркирование ремонтантных сортов малины. Неремонтартные сорта: 1-Новость Кузьмина, 2-Пересвет, 3- Рубин брянский, 4- Брянская, 5- Бальзам, 6- Вольница; Ремонтантные сорта: 7-Элегантная, 8-Надежная, 9-Августина, 10- Заря вечерняя, 11- Абрикосовая, 12-Бабье лето1, 13-Бабье лето2, 14-Геракл, М-маркер размеров (1216,1045, 926,632,313,241). 2.3. Молекулярно-генетические маркеры для исследования генетического разнообразия и маркирования признаков у огурца. 2.3.1. ISSR полиморфизм. Уровень ISSR полиморфизма был иучен на двух сортах, двух коммерческих гибридах F1 и 14 селекционных линиях различного происхождения. Четырнадцать из 19 использованных праймеров выявили различный уровнь полиморфизма, который варьировал от 10 до 80%. Несмотря на высокий полиморфизм применение этого метода для маркирования устойчивости огурца к мучнистой росе не позволило выявить маркеров этого признака. Таким образом, мы изучили полиморфизм межмикросателлитных последовательностей геномной ДНК видов, сортов и линий рода Lycopersicon, Humulus, Cucumber и Rubus с помощью ISSR-PCR. Метод ISSR-PCR, который позволяет амплифицировать последовательности ДНК, расположенные между соседними повторяющимися последовательностями ДНК – микросателлитами, показал себя как простой, эффективный и надёжный метод изучения полиморфизма генома томатов. Проведение экспериментов в ходе исследования часто было разорвано по времени, при этом использовались разные партии реактивов. В таких условиях метод ISSR-PCR проявил высокую воспроизводимость результатов, что является одним из важнейших критериев, определяющих эффективность различных молекулярно-генетических методов. Как и RAPD-PCR, ISSR-PCR не требует знания нуклеотидной последовательности ДНК для создания праймеров, что является преимуществом этих методов молекулярного маркирования. Однако, ISSR-PCR проявляет более высокую воспроизводимость по сравнению с RAPD-PCR. Это связано с тем, что ISSR-праймеры могут быть использованы при гораздо более высоких температурах отжига в ходе амплификации, чем достигается высокая специфичность реакции (Kojima et al., 1998). Кроме того, ISSR-PCR позволяет получить комбинированные фрагменты ДНК, которые состоят из универсальной части, соответствующей какому-либо микросателлиту, и специфической межмикросателлитной последовательности. Данные, полученные с помощью ISSR-PCR, могут отражать как полиморфизм межмикросателлитных последовательностей, так и особенности организации в геномах изучаемых растений самих микросателлитов. 2.4. Анализ гомологов генов устойчивости к фитопатогенам. Наиболее актуальным на сегодняшний день является создание сортов и линий растений с генетической устойчивостью к фитопатогенам. К настояшему времени клонирован ряд генов устоичивости, проведена их молекулярная характеристика и выявлены их консервативные области (Feuillet at al., 2003, Wisser at al, 2005). Таким образом, с помощью амплификации с праймерами на консервативные домены можно клонировать последовательности гомологичные генам устойчивости к фитопатогенам 2.4.1. Огурец. Нами было использовано 10 пар праймеров на различные домены генов устойчивости. В результате была получена амплификация фрагментов различной длины, хорошо разделяемых в полиакриламидном геле. Полученный полиморфизм был использован для маркирования усточивости огурца к мучнистой росе. При использовании изогенных линий был получен фрагмент, который маркировал этот признак (Рис. 16). 
Рис.16. Электрофоретические профили ПЦР продуктов образцов огурца при использовании пары праймеров XLLR. 1-7 – неустойчивые образцы; 8 - 14 – устойчивые образцы;15 – маркер «100 bp leader». 2.4.2. Подсолнечник. С использованием комбинаций вырожденных праймеров, созданных на основе консервативных NBS - доменов генов устойчивости, нами проведена амплификация и последующее клонирование фрагментов аналогов генов устойчивости подсолнечника Helianthus argophyllus. Сиквенсы клонированных ПЦР - продуктов различались между собой и имели сродство к отрезкам NBS - доменов уже известных генов устойчивости и аналогов генов устойчивости растений, относящиеся к разным классам. Наибольшее сходство выявлено с участками NBS - доменов культурного подсолнечника и других представителей семейства сложноцветных. Два клонированных фрагмента имеют открытую рамку считывания, остальные последовательности имеют стоп-кодоны, являясь, по-видимому, псевдогенами. Проанализированные аминокислотные последовательности Helianthus argophyllus включают в себя консервативные участки, свойственные NBS домену продуктов генов устойчивости. Таким образом, наличие полиморфизма между гомологами генов устойчивости может быть использовано при создании молекулярно-генетических маркеров. 3. Разработка и создание ДНК маркеров на хозяйственно-ценные признаки для оценки исходного материала и ускорения селекционного процесса. 3.1. Маркеры, связанные с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС). ЦМС растений широко используется в сельском хозяйстве при производстве гибридных семян. Она позволяет устранить затраты, связаные с ручной кастрацией, и тем самым снизить себестоимость семян. Растения с ЦМС образуют стерильную пыльцу, которая не способна к оплодотворению. Это явление известно у многих сельскохозяйственных культур. ЦМС является результатом взаимодействия цитоплазматических и ядерных компонентов. Многочисленные исследования сосредоточены на различиях в митохондриальных геномах между линиями с ЦМС и их линиями закрепителями. Однако высокая степень полиморфизма митохондриального генома между линией с ЦМС и ее закрепителями не позволяет идентифицировать митохондриальные факторы, контролирующие мужскую стерильность. 3.1.1. Рис (Oryza sativa). Геномную ДНК ЦМС линий (А линий) и их линий закрепителя (B линий) риса использовали в качестве матрицы для ПЦР анализа. Амплификация митохондриальной ДНК RAPD-методом. Для выявления полиморфизма митохондриальной ДНК между ЦМС линиями и их закрепителями ЦМС использовали RAPD метод с применением 34 RAPD-праймеров (Operon Technology, USA). Геномную ДНК ЦМС линии Neda-А (А линии) и ее линии закрепителя Neda-B (B линии) использовали в качестве матрицы для ПЦР с RAPD-праймерами. В RAPD - анализе, 30 из 34 праймеров воспроизводимо амплифицировали ДНК, среди которых четыре выявили полиморфизм между линией ЦМС Neda-A и ее фертильным аналогом закрепителем Neda-B. Праймеры OPA09, OPA14, OPC02 и OPC05, с высокой воспроизводимостью выявляли полиморфные фрагменты между двумя изогенными линиями. OPA09 и OPA14 амплифицировали специфичные фрагменты для стерильной линии, длиной ~200 п.н и ~800 п.н., соответственно. Для идентификации RAPD маркеров и их ассоциации с цитоплазматической мужской стерильностью, ДНК 4-х стерильных линий и их линий закрепителей была амплифицирована с 4 идентифицированными полиморфными RAPD праймерами. Только один RAPD- праймер (OPC05) амплифицировал фрагмент, размером ~500 п.н, специфичный для всех 4-х линий ЦМС (рис.17). 
Рис. 17. ПЦР амлификация RAPD-праймером OPC05. P1: Neda-A и B; P9: IR67017-180-2-1-2-A и B; P10: Usen-A и B; P11: IR68897-A и B. Стрелками показан полиморфный бэнд. При амлификации ДНК 4-х ЦМС линий и линий закрепителей с использованием комбинации RAPD- праймеров серии А (OPА01-04) и серии B (OPB02-04), всего 12 пар, праймеры OPA01-OPB04 выявили полиморфизм между ЦМС линиями и линиями закрепителями. С комбинацией праймеров OPA01-OPB04 амплифицировался полиморфный фрагмент размером ~370 п.н., специфичный для ЦМС линий (рис. 18).
Рис. 18. ПЦР с комбинацией RAPD-праймеров OPA01-OPB04 Эти результаты отражают различие в цитоплазматическом геноме линий с ЦМС и их закрепителей. Обнаруженные RAPD-маркеры могут использоваться для создания линий с ЦМС в селекционных программах гибридного риса, а также в оценке чистоты семян.
Рис. 17. Образцы ПЦР - амплификации праймером SCARmt01. S- ЦМС. N- закрепитель Результаты секвенирования показали, что фрагмент ДНК у линии закрепителя (IR68897-B) на 6-7 п.н. длиннее, чем у ЦМС линий. Сравнение секвенированной последовательности локуса SCARmt01 у ЦМС линии “Neda-A” с последовательностями ДНК базы данных ГенБанк показало, что данная последовательность почти полностью (96%) гомологична участку митохондриальной последовательности риса линии 93-11 (подвида indica) и линии Nipponbare (подвида japonica). Выявление молекулярных маркеров генов восстановления фертильности риса. С целью выявления полиморфных молекулярных маркеров, сцепленных с Rf-генами, первоначально была проведена ПЦР - амплификация ДНК восьми генотипов (Neda-A, IR24, IR28, IR36, IR62030, IR60966, Amol1 и Amol2) с использованием 2-х SSR-праймеров, имеющих сцепление с Rf3 и Rf4 генами. SSR маркер RM1 имеет сцепление с Rf3 геном на коротком плече 1-ой хромосомы (He et al., 2002), а RM171 с Rf4 на длинном плече 10-ой хромосомы (Jing et. al, 2001). Оба праймера детектировали полиморфизм между ЦМС линией (Neda-A) и 7 фертильными линиями. Для проведения первоначального анализа, индивидуальные растения F2 разделяли на две группы, состоящие из десяти растений каждая (BSA- анализ). При этом, группы растений различаются между собой по аллелям исследуемого гена, распределение же остальных признаков в пределах группы - случайное. Результат этого первоначального тестирования показал, что SSR- маркер RM1 в популяциях Neda-A/IR36 и Neda-A/IR60966, сцеплен с Rf3 геном на коротком плече 1-ой хромосомы, а RM171- с Rf4 в популяциях Neda-A/IR24, Neda-A/IR28, Neda-A/Amol1 и Neda-A/Amol2 на длинном плече 10-ой хромосомы. Высокоразрешающее картирование региона гена Rf4. Так как Rf4 ген был картирован между двумя маркерами RM171 и RM304, нами выбраны допольнителные SSR- маркеры на генетической карте риса [McCouch et al., 2002] и разработаны новые праймеры на основе последовательностей EST- и RFLP-маркеров в этом регионе. Праймеры (SPRFA01-03), созданные на основе последовательности ранее клонированого гена Rf1A, не выявляли полиморфизма между родительскими линиями даже после рестрикции с 14 рестриктазами (CAPS-маркеры). Кроме того, два других RFLP- маркера (S10019 и S12564) не обнаруживали полиморфизм между двумя родительскими линиями. BSA-анализ показал, что один SSR маркер, RM6737, находится в этом регионе и был тесно сцеплен с Rf4 геном на расстоянии 1.6 сМ. Кроме вышеупомянутых маркеров, два разработанных нами праймера на основе последовательности AB110443 (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/), AB443 F и R, амплифицировали два полиморфных фрагмента ДНК, специфичных для стерильной линии, размерами ~400 и ~500 п.н., соответственно. Они были тесно сцеплены с рецессивным rf4-аллелем (рис. 18) на расстоянии ~0.5 и 1.03 сМ, соответственно. Эти два маркера локализованы на теломерной стороне между RM171 и геном Rf4. 
Рис. 18. Высокоразрешающее картирование Rf4 гена на длинном плече 10-ой хромосомы риса Физическая локализация гена Rf4. Для определения физической локализации Rf4- гена и сцепленных с ним маркеров использовали программу BLASTN (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Genome/PlantBlast.shtml?5) в базе данных геномной последовательности ДНК сорта 93-11 (http://rise.genomics.org.cn/rice/index2.jsp). Этот поиск дал возможность идентификации контигов, несущих сцепленные с Rf4 маркеры, от SSR- маркера RM6737 на одной стороне (центромерной) до маркера AB443 на другой (теломерной). Сравнение последовательностей праймеров SSR- маркера RM6737 и праймеров AB443 с последовательностью ДНК сорта 93-11 показало, что последовательности праймеров RM6737 находятся в контиге Ctg030205, а последовательности праймеров AB443 - в Ctg030228. Физическая карта, построенная на основе этих данных состояла из 15 контигов, охватывая ~206 т.п.н подвида indica риса. Так как общей характерной особеннотью Rf-генов растений является кодирование пентатрикопептидного (PPR) белка, имеющего в своём N-конце последовательность, необходимую для транспорта в митохондрию [Bentolila et al., 2002; Akagi et al., 2004], этот регион был проанализирован на наличие таких генов программами MitoProt II (http:// ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html) и Pfam 11.0 (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). Результаты этого анализа показали, что среди ~45 генов в этом регионе, только пять генов, включая OsIFCC036677, OsIFCC036680, OsIFCC036693, OsIFCC036694 и OsIFCC036695на контигах Ctg30207, Ctg30216, Ctg30225, Ctg30225 и Ctg30227, соответственно, удовлетворяли критериям характерным для Rf- генов (рис. 19). 
Рис. 19. Структура фрагмента ДНК, несущего маркеры, сцепленные с Rf4- геном на 10-ой хромосоме подвида риса indica В нашем исследовании молекулярные маркеры, сцепленные с геном восстановления фертильности ЦМС WA-типа риса, были успешно идентифицированы и картированы на длинном плече 10-ой хромосомы с использованием SSR-маркеров и разработанных нами праймеров в комбинации с BSA-анализом. Сравнение разных молекуляных карт сцепления маркеров показывает, что три гена восстановления фертильности 3-х ЦМС-типов (BT, HL и WA) тесно сцеплены на длинном плече 10-ой хромосомы риса. Однако, как показано в нашей работе, три пары праймеров, разработаные на основе последовательности гена Rf1A не выявили полиморфизм между исходными родителями даже после обработки с 14 рестриктазами. Поскольку данный ген является функциональным для ЦМС BT-типа, т. е. линии, несущие Rf1A восстановливают фертильность ЦМС BT, а не ЦМС WA (например, линия MTC-10R, несущая данный ген, восстановливает фертильность только для ЦМС BT; [Akagi et al., 2004]), можно отметить, что ген восстановления фертильности ЦМС WA отличается от гена Rf1A. жүктеу/скачать 7.09 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|
